[发明专利]一种膀胱原代神经元的分离提取方法

摘要

本发明提供一种膀胱原代神经元的分离提取方法，涉及生物工程技术领域，本发明将膀胱体洗涤剪碎后，依次用二型胶原酶和胰蛋白酶进行消化，所得消化物细胞过滤后，将过滤液接种在神经元完全培养基中培养，从而分离得到膀胱原代神经元。本发明提供的方法通过对取材、消化和培养方面的优化，成功的从膀胱体中分理处膀胱原代神经元，能实现利用多种方法进行镜检鉴定，很好的保证了膀胱原代神经元的细胞活力，满足以大鼠膀胱原代神经元细胞为试验对象的试验需求。膀胱原代神经元的成功分离提取可为进一步展开膀胱神经源性病变的研究奠定基础。

主权项

1.一种膀胱原代神经元的分离提取方法，包括以下步骤：(1)取膀胱体，以无菌的克氏液洗涤后剪碎，得到预处理膀胱样品；(2)以二型胶原酶消化所述预处理膀胱样品，离心弃去上清，得到第一消化物；(3)以胰蛋白酶消化所述第一消化物3～7min，离心弃去上清，得到第二消化物；(4)将所述第二消化物与神经元完全培养基混合，细胞过滤器过滤，将过滤液摇床培养20～40min后，离心弃去上清，所得沉淀以神经元完全培养基重悬后加入到预先包被有多聚‑D‑赖氨酸和层黏连蛋白的细胞爬片上培养4～7d，培养48h后全量换液，培养48～96h后再次全量换液；所述神经元完全培养基以Neurobasal‑A培养基为基础培养基，还包括：质量浓度1～3％的B‑27型无血清添加剂、质量浓度0.2～2％的L‑谷氨酰胺、质量浓度0.05～0.2％的GDNF和质量浓度1～5％的100×抗菌‑抗真菌剂。