[发明专利]利用CRISPR/Cas9系统大片段敲除绵羊MSTN基因的方法在审
| 申请号： | 201910646779.7 | 申请日： | 2019-07-17 |
| 公开（公告）号： | CN110305910A | 公开（公告）日： | 2019-10-08 |
| 发明（设计）人： | 寇启芳;牛文智;王小龙;马虎;牛晓莲;周颖;刘卫平 | 申请（专利权）人： | 吴忠市红寺堡区天源农牧业科技开发有限公司 |
| 主分类号： | C12N15/90 | 分类号： | C12N15/90;C12N15/12;A01K67/027;C12N15/113;C12N15/63 |
| 代理公司： | 北京弘权知识产权代理事务所(普通合伙) 11363 | 代理人： | 逯长明;许伟群 |
| 地址： | 751900 宁夏回*** | 国省代码： | 宁夏;64 |
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| 摘要： | 本发明公开了一种利用CRISPR/Cas9系统大片段敲除绵羊MSTN基因的方法，本发明首先获得针对绵羊MSTN基因第一外显子,第二外显子和第三外显子的sgRNA识别区的DNA序列；接着分别构建针对绵羊MSTN第一外显子，第二外显子和第三外显子且含T7启动子的sgRNA体外转录载体；利用Cas9和sgRNA的体外转录载体通过体外转录获得Cas9mRNA和sgRNA，通过受精卵注射可用于生产大片段敲除MSTN基因的转基因绵羊。 | ||
| 搜索关键词： | 绵羊MSTN基因 敲除 体外转录载体 第三外显子 第一外显子 外显子 大片 转基因绵羊 受精卵 体外转录 识别区 构建 可用 绵羊 注射 生产 | ||
【主权项】：
1.一种利用CRISPR/Cas9系统大片段敲除绵羊MSTN基因的方法，其特征在于，包括以下步骤：S1、根据NCBI中绵羊基因组序列，选择绵羊基因组中MSTN基因第一外显子，第二外显子和第三外显子作为靶位点设计sgRNA；S2、构建sgRNA的体外转录载体pUC57‑T7‑sgRNA和pST1374‑NLS‑flag‑linker‑Cas9以及载体Cas9mRNA；S3、利用构建好的载体pUC57‑T7‑sgRNA和Cas9mRNA的体外转录载体pST1374‑NLS‑flag‑linker‑Cas9进行以T7启动子介导的体外转录并进行纯化；得到sgRNA；S4、将sgRNA、Cas9mRNA混合，注射入绵羊受精卵细胞质中，然后经体外培养后移植入同种雌性绵羊输卵管中，用于生产大片段敲除MSTN的转基因绵羊。
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