[发明专利]一种绿原酸对心肌肥大的保护作用研究方法

摘要

本发明涉及心肌健康技术领域，且公开了一种绿原酸对心肌肥大的保护作用研究方法，通过H9C2心肌细胞的培养、原代心肌细胞的分离培养、细胞核蛋白的抽提、MTT法检测Iso和CGA药物毒性、细胞免疫荧光、试验分组及药物处理、细胞划痕、流式细胞术检测细胞凋亡、蛋白免疫印迹、荧光定量聚合酶链式反应、细胞内活性氧水平检测和数据分析的步骤来观察绿原酸对心肌肥大的保护作用与效果，同时也确保绿原酸对心肌的危害性，该一种绿原酸对心肌肥大的保护作用研究方法，通过在冰箱中使用冻存液保存细胞，冻存液采用70％DMEM培养基、20％的胎牛血清和10％的DMSO，DMSO可以有效防止细胞内冰晶形成而损伤细胞。

主权项

1.一种绿原酸对心肌肥大的保护作用研究方法，其特征在于：包括以下步骤：S1、H9C2心肌细胞的培养；S2、原代心肌细胞的分离培养；S3、细胞核蛋白的抽提；S4、MTT法检测Iso和CGA药物毒性：S4.1、细胞铺盘：细胞计数后向两个96孔板中分别依次加入5000个左右的H9C2细胞和原代心肌细胞；S4.2、药物的配置：制作Iso和CGA的母液，分别用吸入含有药物的培养基经滤器过滤，将一份Iso的母液加入细胞培养基进行一千倍稀释后成为Iso的细胞培养液，将一份CGA的母液加入细胞培养基中进行100倍稀释后成为CGA的细胞培养基；S4.3、药物处理：S4.3.1、隔夜待细胞贴壁后分别加入稀释的Iso和CGA细胞培养基，每个药物浓度设置6个平行复孔，四周边缘用无菌PBS填充；S4.3.2、含Iso和CGA药物的培养基细胞分别在孵育了48h和2h后更换信心的细胞培养基；S4.3.3、每孔加入MTT溶液后继续培养一段时间，然后终止培养并吸弃孔内含MTT的细胞培养液；S4.3.4、每孔加入二甲基亚砜，并放在微凉振荡器上低速震荡；S4.3.5、建立柱状图，同时设置对照组进行计算；S5、细胞免疫荧光：操作方式与2.6的步骤类似，一抗换用索要检测的相应蛋白质抗体，二抗根据一抗宿主的来源确定带不同荧光标签的二抗；S6、试验分组及药物处理：经过MTT法的分析，选择一个值作为Iso的药物诱导浓度，并选择几个数值作为CGA的保护药物剂量，同时将细胞分为五个实验组进行试验；S7、细胞划痕；S8、流式细胞术检测细胞凋亡：S8.1、实验准备：将10×Annexin V Binding Buffer用双蒸水十倍稀释，制成1×工作液；S8.2、细胞收集：取出培养好的细胞，用PBS洗涤两边，然后加入不含EDTA的胰酶消化贴壁的细胞，消化完成后加入细胞培养基终止消化，将消化的细胞液转移至离心管中进行离心并弃去上清液，加入PBS反复洗涤后，每次吹打悬浮后都进行离心，然后加入1×Binding Buffer悬浮细胞；S8.3、细胞的染色：吸取细胞悬浮液转移到流式管中，然后每个样品加入FITC Annexin V和PI并进行震荡孵育；S8.4、细胞检测：向每个流式管中加入400μl 1×Binding Buffer，然后在一段时间内用流式细胞仪分析；S9、蛋白免疫印迹：S10、荧光定量聚合酶链式反应(Quantitative Real‑Time PCR，qPCR)：S10.1、qPCR引物的设计和合成：引物设计选择打分高的序列，设计好的引物序列交上海生工合成，获得qPCR引物后，内参基因选用GAPDH；S10.2、按照RNA抽提试剂盒提示进行RNA的提取：S10.2.1、试剂、耗材的准备：将所有实验器材浸泡并杀菌后烘干，在处理适量的双蒸水；S10.2.2、吸尽细胞培养皿的培养液后加入Trizol，吹打细胞全部裂解后转移到离心管中；S10.2.3、向离心管中加入氯仿，然后震荡；S10.2.4、离心一段时间后将上清液转移到另一个离心管中；S10.2.5、向上清液中加入等体积的异丙醇后振荡30s，紧接着离心20‑30min，最后吸弃上清液，可以看到RNA沉淀；S10.2.6、向含RNA沉淀的离心管加入乙醇后振荡，紧接着离心后吸弃上清液，再重复操作一次；S10.2.7、快速离心RNA沉淀后除去残留的乙醇，将RNA沉淀放入超净台中风吹后加入去RNase水，最后震荡溶解；S10.3、RNA浓度和纯度检测：S10.3.1、NanoDrop分光光度法检测：吸一些RNA溶液，用微量分光光度计NanoDrop检测RNA的浓度值以及A260/A280和A260/A230的比值，然后根据结果得出RNA的纯度；S10.3.2、电泳法检测：配置琼脂糖后提取RNA溶液，加入适量的核酸上样缓冲液，在100V条件下水平电泳15min左右，查看电泳图；S10.4、cDNA文库的构建(reverse transiption‑PCR，RT‑PCR)：按照First‑Strand cDNA Synthesis SuperMix进行操作后，配制第一条链cDNA合成的反应体系，然后放入常规PCR仪中孵育两次后加热失活；S10.5、实时定量PCR(real‑time PCR，qPCR)：以各组样品的cDNA文库为模板，配制反应体系，然后使用荧光燃料法进行反应；S10.6、数据分析：使用ΔΔCT法计算得出的数据；S11、细胞内活性氧(Reactive Oxygen Species，ROS)水平检测：利用荧光探针穿过细胞膜进入细胞内后会被水解生成DCFH，而DCFH不能通透细胞膜，从而使探针很容易被装载到细胞内，细胞内的活性氧可以氧化无荧光的DCFH生成有荧光的DCF。从而通过检测DCF的荧光估算细胞内活性氧的水平；S12、数据分析。