[发明专利]基于枝状DNA的靶标触发信号级联放大的核酸检测方法

摘要

本发明公开了基于枝状DNA的靶标触发信号级联放大的核酸检测方法，步骤为：制备一种n枝状DNA和一种不同于n枝状的粘性末端的m枝状DNA，将5'端修饰有巯基基团的核酸探针分子通过巯基连接在金基底表面，加入待测靶标核酸分子，反应，至生物传感器检测信号稳定，加入n枝状DNA，反应，至生物传感器检测信号稳定，加入待测靶标核酸分子，反应，至生物传感器检测信号稳定，加入m枝状DNA，反应，至生物传感器检测信号稳定；直至加入一种n枝状DNA或m枝状DNA后生物传感器检测信号不再波动，最终显示出级联放大的待测靶标核酸分子检测信号。本发明操作简便，无需酶的参与，无需分子标记，成本低廉，适用范围广泛。

主权项

1.基于枝状DNA的靶标触发信号级联放大的核酸检测方法，其特征是包括如下步骤：/n(1)制备一种n枝状DNA：/n设计并合成均带有相同的粘性末端的n条DNA单链；分别溶于水中，振荡，得到n份终浓度为100μM的DNA单链水溶液；n＝3或4；/n第1条DNA单链从3'端到5'端，分为1-1段、1-2段和1-3段；1-1段和1-2段之和的DNA单链的核苷酸数为28-44个，1-3段的DNA单链为粘性末端，其核苷酸数为11-15个，共计39-59个；/n第2条DNA单链从3'端到5'端，分为2-1段、2-2段和2-3段；2-1段和2-2段之和的DNA单链的核苷酸数为28-44个，2-3段的DNA单链为粘性末端，其核苷酸数为11-15个，共计39-59个；/n第n条DNA单链从3'端到5'端，分为n-1段、n-2段和n-3段，n-1段和n-2段之和的DNA单链的核苷酸数为28-44个；n-3段的DNA单链为粘性末端，其核苷酸数为11-15个，共计39-59个；/n第1条DNA单链的1-2段核苷酸序列与第2条DNA单链的2-1段核苷酸序列反向互补配对；/n第2条DNA单链的2-2段核苷酸序列与第n条DNA单链的n-1段核苷酸序列反向互补配对；/n第n条DNA单链的n-2段核苷酸序列与第1条DNA单链的1-1段核苷酸序列反向互补配对；/n第1条DNA单链的1-3段核苷酸序列、第2条DNA单链的2-3段核苷酸序列、第n条DNA单链的n-3段核苷酸序列与待测靶标核酸分子的5'端的一半序列均反向互补配对；/n取等体积的n份DNA单链水溶液，按照n条DNA单链的等摩尔比混合，加入终浓度为80mM的NaCl水溶液，加热至95℃再降至室温，制备得到n枝状DNA；/n(2)制备一种m枝状DNA：/n设计并合成均带有相同的粘性末端的、不同于步骤(1)粘性末端的m条DNA单链；分别溶于水中，振荡，得到m份终浓度为100μM的DNA单链水溶液；m＝3或4；/n第1条DNA单链从5'端到3'端，分为1-1段、1-2段和1-3段；1-1段和1-2段之和的DNA单链的核苷酸数为28-44个，1-3段的DNA单链为粘性末端，其核苷酸数为11-15个，共计39-59个；/n第2条DNA单链从5'端到3'端，分为2-1段、2-2段和2-3段；2-1段和2-2段之和的DNA单链的核苷酸数为28-44个，2-3段的DNA单链为粘性末端，其核苷酸数为11-15个，共计39-59个；/n第m条DNA单链从5'端到3'端，分为m-1段、m-2段和m-3段，m-1段和m-2段之和的DNA单链的核苷酸数为28-44个；m-3段的DNA单链为粘性末端，其核苷酸数为11-15个，共计39-59个；/n第1条DNA单链的1-2段核苷酸序列与第2条DNA单链的2-1段核苷酸序列反向互补配对；/n第2条DNA单链的2-2段核苷酸序列与第m条DNA单链的m-1段核苷酸序列反向互补配对；/n第m条DNA单链的m-2段核苷酸序列与第1条DNA单链的1-1段核苷酸序列反向互补配对；/n第1条DNA单链的1-3段核苷酸序列、第2条DNA单链的2-3段核苷酸序列、第m条DNA单链的m-3段核苷酸序列与待测靶标核酸分子的3'端的一半序列均反向互补配对；/n取等体积的m份DNA单链水溶液，按照m条DNA单链的等摩尔比混合，加入终浓度为80mM的NaCl水溶液，加热至95℃再降至室温，制备得到m枝状DNA；/n(3)将5'端修饰有巯基基团的核酸探针分子通过巯基连接在金基底表面，所述核酸探针分子的核苷酸从5'端到3'端分为p-1段和p-2段，共有核苷酸21-25个；p-1段核苷酸数为10个，均为腺嘌呤核苷酸，p-2段核苷酸数为11-15个，p-2可与待测靶标核酸分子3'端的一半序列互补配对；/n(4)在步骤(3)获得的连接有核酸探针分子的金基底加入待测靶标核酸分子，反应，至生物传感器检测信号稳定，加入一种n枝状DNA，反应，至生物传感器检测信号稳定，加入待测靶标核酸分子，反应，至生物传感器检测信号稳定，加入一种m枝状DNA，反应，至生物传感器检测信号稳定；/n(5)重复步骤(4)，直至加入一种n枝状DNA或一种m枝状DNA后生物传感器检测信号不再波动，最终显示出级联放大的待测靶标核酸分子检测信号。/n