[发明专利]一种抗口蹄疫病毒猪源单链基因工程抗体的制备方法

摘要

本发明涉及一种抗口蹄疫病毒猪源单链基因工程抗体的制备方法，属于抗体制备技术领域。从口蹄疫病毒抗原免疫猪体内分离PBMCs，使用染料标记FMDV 146S抗原，对PBMCs进行染色，借助多色流式细胞仪分选结合FMDV的单个B细胞；结合单细胞抗体基因测序，分别获得VH和VL基因，通过柔性linker及CHO‑S表达工程抗体技术，表达获得FMDV特异性猪源单链基因工程抗体。本发明所述制备方法获得的抗体具有基因多样性好，效率高，全宿主(猪)来源，需要细胞量少等优势。

主权项

1.一种抗口蹄疫病毒猪源单链基因工程抗体的制备方法，包括以下步骤：1)从免疫口蹄疫病毒抗原的猪血液样本中分离外周血单个核细胞；2)对FMDV 146S抗原进行超滤离心，得到浓缩后的FMDV 146S抗原，使用染料对浓缩后的FMDV 146S抗原进行染色，将染色后的抗原进行超滤离心，得到标记后的FMDV 146S抗原；3)将步骤1)得到的外周血单个核细胞与步骤2)得到的标记后的FMDV 146S抗原、鼠抗猪IgM‑PE和鼠抗猪IgG‑FITC荧光抗体混合，得到染色后的细胞；4)使用多色流式细胞仪分选FMDV特异性单个B细胞；5)对步骤4)得到的FMDV特异性单个B细胞进行反转录，得到cDNA后，利用如SEQ ID NO.1～16所示的引物进行巢式PCR扩增，得到猪IgG重链可变区基因、Lambda轻链可变区基因和Kappa轻链可变区基因；6)将步骤5)得到的猪IgG重链可变区基因分别和Lambda轻链可变区基因、Kappa轻链可变区基因通过如SEQ ID NO.17所示的柔性Linker连接，在连接后的基因的N端分别引入如SEQ ID NO.18所述的信号肽序列，在C端分别引入Myc标签和His标签，参考Cricetulus griseus密码子分别进行基因序列优化，在优化后的基因起始密码子前分别引入KOZAK序列，分别插入到pcDNA3.4表达载体，得到Lambda猪源单链抗体表达载体和kappa猪源单链抗体表达载体；7)将步骤6)得到Lambda猪源单链抗体表达载体和kappa猪源单链抗体表达载体分别转染细胞进行抗体的表达；所述步骤1)和2)没有时间先后顺序的限定。