[发明专利]一种水稻Wx基因突变的鉴定方法及其应用

摘要

本发明公开了一种水稻Wx基因突变的鉴定方法，包括：提取待测水稻植株基因组构建DNA混合池，同时提取对照水稻植株的基因组DNA；针对Wx基因设计4对巢式PCR引物；以待测水稻植株基因组构建的DNA混合池和对照水稻植株的基因组DNA为模板分别进行巢式PCR；对PCR产物进行HRM分析，确定疑似突变混合池；分别提取疑似突变混合池对应的单株DNA，将单株DNA与对照植株DNA混合进行巢式PCR，扩增产物进行HRM分析获得疑似突变单株，以其DNA为模板进行PCR并进行琼脂糖凝胶电泳鉴定。本发明将TILLING技术与HRM检测手段相结合应用于水稻Wx基因的突变筛选，为水稻诱变后代高效定向筛选提供了新思路。

主权项

1.一种水稻Wx基因突变的鉴定方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)以未经诱变处理的水稻植株为对照植物，以经诱变处理的水稻植株为待测植株，提取待测植株基因组构建DNA混合池，同时提取对照植株的基因组DNA；(2)根据已公布的Wx基因序列，在其4、9、10外显子区域以及Wx^a和Wx^b差异位点设计巢式PCR外引物和内引物，分别以待测植株构建的DNA混合池和对照植株的基因组DNA为模板，加入所述巢式PCR引物的外引物，进行第1轮PCR扩增，扩增结束后加入ddH₂O稀释；(3)以步骤(2)中PCR稀释后产物为模板，加入巢式PCR内引物和荧光染料，进行第2轮PCR扩增，扩增结束后，需再进行1个循环；(4)将步骤(3)所得第2轮扩增产物分别离心并转移至HRM检测板中，进行HRM检测分析，以对照植株所对应的HRM曲线为基准线，比较待测植株所对应的HRM曲线与对照植株所对应的HRM曲线的最大荧光差异ΔF；若|ΔF|>0.05，视为待测植株与对照植株的结果不同，初步判定该DNA混合池中存在突变位点的植株，视为疑似突变混合池；(5)将步骤(4)中筛选得到的疑似突变混合池对应的单株分别提取DNA并稀释，将单株DNA与对照植株DNA按一定比例混合进行巢式PCR扩增，扩增产物进行HRM检测分析，其方法同步骤(2)—(4)；(6)以筛选得到的疑似突变单株DNA为模板进行PCR扩增，所用引物为步骤(2)中所述巢式RCR引物的外引物；(7)PCR产物经琼脂糖凝胶电泳检测，条带明显且单一的，进行测序，确定具体的突变位点；其中，所述针对Wx基因序列第4外显子区域设计的巢式PCR外引物和内引物，其序列如下：EX4‑O外引物‑上游引物：5’—CAGATCATCACAAGATCGATTAGC—3’，EX4‑O外引物‑下游引物：5’—AACCTGAAATCACCAGTGGAAG—3’，EX4‑I内引物‑上游引物：5’—CCAAGTTTTTGTGGTGCAATTC—3’，EX4‑I内引物‑下游引物：5’—TAAGCTCAGTCCAACTGCTAAATG—3’；所述针对Wx基因序列第9外显子区域设计的巢式PCR外引物和内引物，其序列如下：EX9‑O外引物‑上游引物：5’—CGACGGGTATGAGTAAGATTCTAAG—3’，EX9‑O外引物‑下游引物：5’—CATTCGTTCTTACCGTGGTTG—3’，EX9‑I内引物‑上游引物：5’—AGATCCTTTTGAGCTGACAACC—3’，EX9‑I内引物‑下游引物：5’—GTACTTGGCGGTGATGTACTTG—3’；所述针对Wx基因序列第10外显子区域设计的巢式PCR外引物和内引物，其序列如下：EX10‑O外引物‑上游引物：5’—AGAACGAATGCATTCTTCACAAGA—3’，EX10‑O外引物‑下游引物：5’—GCCTCACCCCTTCTAATTATTTGA—3’，EX10‑I内引物‑上游引物：5’—ACAAGGCAAGAATGAGTGACAA—3’，EX10‑I内引物‑下游引物：5’—GCATATCGTGCAAGTGTGTCTT—3’；所述针对Wx基因序列Wx^a和Wx^b差异位点设计巢式PCR外引物和内引物，其序列如下：Wxab‑O外引物‑上游引物：5’—GAGGGAGAGGGGGAGAGAGAGATC—3’，Wxab‑O外引物‑下游引物：5’—TCCAGCCCAACACCTTACAGAAAT—3’，Wxab‑I内引物‑上游引物：5’—CTTCACTTCTCTGCTTGTGTTGTT—3’，Wxab‑I内引物‑下游引物：5’—CATGTGATCGATCTGAATAAGAGG—3’。