[发明专利]一种大肠杆菌DH5α高效感受态细胞的制备方法

摘要

本发明公开了一种大肠杆菌DH5α高效感受态细胞的制备方法，其将融化的大肠杆菌在不含抗性的LB固体培养基平板上涂板，并培养；在长出大肠杆菌的单克隆的菌落后挑取，并在不含抗性的LB固体培养基平板上划线分离，在培养后在划线处长出菌苔后挑取一条放入装有灭菌LB液体培养基的第一容器中，再振荡得到第一混合菌液；将第一混合菌液移至装有灭菌LB液体培养基的第二容器中，再振荡得到第二混合菌液；对第二混合菌液离心去上清；用CaCl2溶液重悬得到第一重悬液；对第一重悬液离心去上清；用CaCl2溶液重悬得到第二重悬液；对第二重悬液离心去上清；用CaCl2溶液重悬得到第三重悬液，即得到大肠杆菌感受态细胞；优点是其操作简单快速、可重复性高、转化效率高。

主权项

1.一种大肠杆菌DH5α高效感受态细胞的制备方法，其特征在于包括以下步骤：/n步骤一：将-80℃～-70℃下冷冻保藏的大肠杆菌置于超净台上，并在室温环境下融化大肠杆菌；然后将融化的大肠杆菌在第一块不含抗性的LB固体培养基平板上涂板；再在37℃的恒温培养箱中下培养，直至在第一块不含抗性的LB固体培养基平板上长出大肠杆菌的单克隆的菌落；/n步骤二：在第一块不含抗性的LB固体培养基平板上长出大肠杆菌的单克隆的菌落后，挑取大肠杆菌的单克隆的菌落，并在第二块不含抗性的LB固体培养基平板上划线分离；然后在37℃的恒温培养箱中下培养，直至划线处长出菌苔；接着挑取一条菌苔，并放入装有10ml～15ml的灭菌LB液体培养基的第一容器中；再将第一容器置于摇床上，在37℃下以210rpm～240rpm的速度振荡，直至扩大培养得到的第一混合菌液的OD₆₀₀值为1.5～2.2；/n步骤三：将第一混合菌液转移至装有灭菌LB液体培养基的第二容器中，其中，第一混合菌液与灭菌LB液体培养基的体积比为1:20；再将第二容器置于摇床上，在37℃下并以210rpm～240rpm的速度振荡，直至扩大培养得到的第二混合菌液的OD₆₀₀值为0.6～0.8；/n步骤四：将第二混合菌液倒入预冷的离心管中；然后将离心管置于预冷的离心机上，以3500rpm～4000rpm的速度离心处理6～10分钟后，再去掉上清，第一次收集大肠杆菌；/n步骤五：用预冷的浓度为0.1mol/L的CaCl₂溶液重悬第一次收集的大肠杆菌，得到第一重悬液；再对第一重悬液冰浴处理10～15分钟；其中，CaCl₂溶液与倒入预冷的离心管中的第二混合菌液中含有的灭菌LB液体培养基的体积比为1:30；/n步骤六：将第一重悬液倒入预冷的离心管中；然后将离心管置于预冷的离心机上，以3000rpm～3500rpm的速度离心处理5～10分钟后，再去掉上清，第二次收集大肠杆菌；/n步骤七：用预冷的浓度为0.1mol/L的CaCl₂溶液重悬第二次收集的大肠杆菌，得到第二重悬液；再对第二重悬液冰浴处理30～40分钟；其中，CaCl₂溶液与倒入预冷的离心管中的第二混合菌液中含有的灭菌LB液体培养基的体积比为1:30；/n步骤八：将第二重悬液倒入预冷的离心管中；然后将离心管置于预冷的离心机上，以3000rpm～3500rpm的速度离心处理5～10分钟后，再去掉上清，第三次收集大肠杆菌；/n步骤九：用预冷的浓度为0.1mol/L的CaCl₂溶液重悬第三次收集的大肠杆菌，得到第三重悬液，第三重悬液中的大肠杆菌即为大肠杆菌感受态细胞；其中，CaCl₂溶液与倒入预冷的离心管中的第二混合菌液中含有的灭菌LB液体培养基的体积比为1:30。/n