[发明专利]一种解脂耶氏酵母中目的基因多次无痕整合系统及方法

摘要

本发明涉及一种解脂耶氏酵母中目的基因多次无痕整合系统及方法，属于基因工程技术领域。本发明所述系统通过质粒1转化解脂耶氏酵母能够引入lox位点，而后通过质粒2和质粒3依次转化，能够实现目的基因任意次数无痕整合到解脂耶氏酵母基因组。本发明仅需一个酵母筛选标记即可实现目的基因任意次数的整合，同时，本发明极大地降低了非目的基因的引入，且每次整合后的基因组均是已知可控的，这有利于解脂耶氏酵母表达系统在食品、医药、农产品加工等领域的应用。

主权项

1.一种解脂耶氏酵母中目的基因多次无痕整合系统，其特征在于，所述系统包括质粒1、质粒2和质粒3；所述质粒1包括酵母筛选标记、Cre基因表达盒、细菌部分基因片段、同源片段A和两个同向lox位点；两个同向lox位点设在同源片段A两侧，其余元件无顺序要求；两个同向lox位点整合到酵母基因组后发生重组反应，反应后在基因组上生成一个左臂突变型lox位点或一个右臂突变型lox位点；所述同源片段A为解脂耶氏酵母基因组序列，长度不小于1000bp；所述质粒2包括酵母筛选标记、Cre基因表达盒、细菌部分基因片段、同源片段B、两个反向互补的左或右臂突变lox位点和目的基因表达盒；两个反向互补的左或右臂突变lox位点需在目的基因表达盒两侧，且紧靠同源片段B，其余元件无顺序要求；两个反向互补的左或右臂突变lox位点能够与质粒1反应后在基因组上生成的左或右臂突变型lox位点发生重组反应，反应后在基因组生成双臂突变型位点；所述同源片段B位于同源片段A上游或下游序列，长度不小于1000bp；所述质粒3包括酵母筛选标记、Cre基因表达盒、细菌部分基因片段、同源片段B、两个反向互补的左或右臂突变lox位点和目的基因表达盒；两个反向互补的左或右臂突变lox位点需在目的基因表达盒两侧，且紧靠同源片段B，其余元件无顺序要求；两个反向互补的左或右臂突变lox位点能够与质粒2反应后在基因组生成的左或右臂突变型lox位点发生重组反应，反应后在基因组生成双臂突变型位点；同源片段B位于同源片段A上/下游序列，长度不小于1000bp；所述酵母筛选标记包括营养缺陷型标记和抗生素抗性标记；所述Cre基因表达盒由诱导启动子‑Cre基因‑终止子组成；所述细菌部分基因片段包括大肠杆菌复制起点和抗性基因。