[发明专利]一种铵态氮高效利用的核桃砧木培育方法

摘要

本发明公开了一种铵态氮高效利用的核桃砧木培育方法，包括以步骤：1)RNA提取；2)总RNA反转录cDNA；3)PCR扩增；4)核桃JrAMT基因目的片段的回收；5)构建JrAMT‑pC1300过量表达载体；6)核桃JrAMT‑pC1300遗传转化；7)核桃JrAMT基因过量表达植株再生。本发明操作简便，无需昂贵精密的仪器设备，成本低，周期短，同时，再生植株能更高效地利用铵态氮，长势强、遗传稳定性好，苗木健壮、有良好的抗逆性，培育得到的JrAMT基因过量表达阳性再生核桃植株对铵态氮利用率显著高于野生型核桃植株。

主权项

1.一种铵态氮高效利用的核桃砧木培育方法，其特征在于，包括以下步骤：/n1)RNA提取/n对生长良好的核桃体细胞胚取样，进行总RNA提取，获得总RNA提取液；/n2)总RNA反转录cDNA/n将步骤1)得到的总RNA提取液进行逆转录得到cDNA；/n3)PCR扩增/n根据核桃AMT基因的全长序列，设计正向引物和反向引物，以步骤2)得到的cDNA为模板进行扩增；/n4)核桃JrAMT基因目的片段的回收/n向步骤3)得到的扩增产物中加入10×loading Buffer，进行1.5％的琼脂糖凝胶电泳，电泳结束用回收琼脂糖凝胶中的JrAMT基因目的片段；/n5)构建JrAMT-pC1300过量表达载体/n将步骤4)得到的核桃JrAMT基因目的片段与pC1300-GFP载体连接，构建过量表达载体；采用构建的过量表达载体转化大肠杆菌感受态细胞，PCR检测扩增，获取与目的片段大小一致的菌液，从菌液中提取核桃JrAMT-GFP质粒并转化感受态农杆菌；/n6)核桃JrAMT-pC1300遗传转化/n将步骤5)得到的含有JrAMT-GFP载体的农杆菌单菌落进行扩大培养，得到农杆菌工程菌液，并将农杆菌工程菌液浸染生长良好的核桃体细胞胚，并将浸染的核桃体细胞胚置于DKW固体培养中培养；并将共培养的核桃体细胞胚移至DKW固体培养基中筛选培养，获得JrAMT转化阳性体胚；/n7)核桃JrAMT基因过量表达植株再生/n步骤6)得到的JrAMT转化阳性体胚生长至子叶胚阶段接入DKW萌发培养基中，置于光照条件下进行萌发培养，得到JrAMT阳性再生核桃植株。/n