[发明专利]一种基于酵母双杂交技术高效筛选膜蛋白互作蛋白的方法

摘要

本发明涉及一种基于酵母双杂交技术筛选膜蛋白互作蛋白的方法，通过采诱饵蛋白载体的选择、进行自激活检测及诱饵载体功能验证、进行膜体系双杂交文库筛选酵母、质粒提取、酵母质粒的扩繁等步骤，优化了诱饵载体的选择，筛选合适的诱饵载体，可以最大限度的筛选到更多的互作蛋白；优化了酵母感受态细胞的制备过程，通过一种接近于定量的方法较好得把握了摇菌的过程，可以使酵母感受态细胞的状态达到最优，比较有利于文库的表达，可以较好地把握实验进度，提高了实验稳定性；基于泛素系统的膜蛋白互作最后的PCR验证，极大促进了膜蛋白互作研究方法的高效性和稳定性，为科研工作者提供了先进的技术手段和理论基础。

主权项

1.一种基于酵母双杂交技术筛选膜蛋白互作蛋白的方法，该方法包括以下步骤：/n步骤1、诱饵蛋白载体的选择：根据蛋白N端和C端在细胞质膜与胞质的定位以及蛋白N端是否存在信号肽来判断载体的选择，具体选择标准为当诱饵蛋白N端的定位在细胞外或胞腔内，且诱饵蛋白N端含信号肽，诱饵蛋白C端的定位在细胞质时，选择的载体为pBT3-SUC；当诱饵蛋白N端的定位在细胞外或胞腔内，且诱饵蛋白N端无信号肽，诱饵蛋白C端的定位在细胞质时，选择的载体为pBT3-STE；当诱饵蛋白N端的定位在细胞质，诱饵蛋白C端的定位在细胞外或胞腔内时，选择的载体为pBT3-N；当诱饵蛋白N端的定位在细胞质，诱饵蛋白C端的定位在细胞质时，选择的载体为pBT3-N或pBT3-STE；/n步骤二、进行自激活检测及诱饵载体功能验证：以质粒pTSU2-APP和pPR3-N为阴性对照，质粒pTSU2-APP和pNubG-Fe65为阳性对照，进行阴阳对照，分析实验结果；/n步骤三、进行膜体系双杂交文库筛选，挑取酵母菌落，采用高温煮沸和液氮冷却的方法破除酵母细胞壁，具体的操作步骤为：挑取四缺板上成功生长的酵母阳性单菌落，加入10uL0.9％NaCl重悬起单菌落，将离心管放在沸水中煮沸5min，液氮冷却2min，如此重复一次，加入pPR3-N质粒的通用引物以及PCR MIX缓冲液进行菌落PCR验证，对于PCR验证没有条带的菌落抽提质粒进行测序；/n步骤四、酵母质粒提取；/n步骤五、酵母质粒的扩繁。/n