[发明专利]一种利用甘蔗渣生物催化合成木糖醇的方法

摘要

本发明属于木糖醇生物制备领域，具体涉及一种利用甘蔗渣生物催化合成木糖醇的方法，包括甘蔗渣的预处理、蒸汽爆破处理、碱处理、纤维素酶酶解处理、乙醇提取半纤维素、木聚糖酶酶解处理、制备浓缩液、浓缩液中和、基因工程菌的培养和富集和全细胞催化合成木糖醇几个工序。本发明能低成本高效率地制备木糖醇，能够最大限度利用甘蔗渣，将其中的木糖和半纤维素转化成木糖醇。

主权项

1.一种利用甘蔗渣生物催化合成木糖醇的方法，其特征在于主要包括以下步骤：（1）甘蔗渣的预处理：将甘蔗渣烘干至恒重后粉碎处理并过筛，备用；在1‑3g甘蔗粉末中加入适量液氮处理5‑10min，再在研钵中研磨成粉末，然后冷却至室温；将液氮处理好的粉末在烘箱中处理至恒重，加入30‑40mL去离子水，在冰水浴条件下超声处理30‑40min，再在真空冷冻装置中处理成粉末；再往粉末中加入10‑14wt%的γ‑戊内酯和5‑15mL的1,3‑二甲基咪唑磷酸二甲酯，将三种物质共同加入50mL三颈烧瓶中，在温度90‑130℃下搅拌反应；反应结束后，真空抽滤、洗涤和烘干，备用，（2）蒸汽爆破处理： 将预处理后的甘蔗渣与15‑60mL蒸馏水（固液比为1：15‑1:20）混和，倒入蒸汽爆破系统，设置压力为1.0‑1.2MPa，维压时间为10‑15min，过滤得到爆破液和爆破渣，爆破液保留，爆破渣使用去离子水和无水乙醇洗净后烘干至恒重，（3）碱处理：取30‑40mL的10%（wt%）的NaOH溶液与爆破处理的甘蔗渣混和，在60‑65℃水浴中搅拌处理；处理结束后，利用浓HCl调节pH值至5.0‑5.5，（4）纤维素酶酶解处理：将上述处理液混入0.3‑0.5g的纤维素酶，30‑35℃水浴，250‑300rpm搅拌反应1‑2h；（5）乙醇提取半纤维素：将上述处理液于60‑65℃下浓缩体积至原体积的1/3‑1/2，结束后用3倍体积的无水乙醇充分震荡反应，震荡结束后，真空抽滤，用去离子水冲洗，（6）木聚糖酶酶解处理：将上述滤渣与30‑40mL去离子水混和，调节pH=5.0‑6.0，加入0.3‑0.5g木聚糖酶，50‑60℃水浴，250‑300rpm搅拌反应2‑3h，得到的水解液备用，（7）制备浓缩液：将爆破液和水解液混和，60‑70℃水浴浓缩至原料液体积的1/3‑1/4，使用对一溴苯胺定糖法测定木糖浓度，备用，（8）浓缩液中和：将浓缩液使用NaOH调节pH值至6.5‑7.5，（9）基因工程菌的培养和富集：将构建好的含有木糖还原酶基因的大肠杆菌BL21（DE3）甘油保菌在含50μg/mL的LB固体培养基进行划线接种，37℃培养过夜；将得到的单菌落挑取1‑2个转接到50mL含50μg/mL的LB液体培养基中，重复转接多个，37℃，200rpm震荡培养至OD600=0.6～0.8，加入50μL 0.5mol/L的IPTG至培养基终浓度为0.5mmol/L，25℃，200rpm震荡诱导培养过夜；诱导结束后在8000rpm转速下离心5min，弃去上清液，收集菌体备用，再用pH=7.2‑7.4的PBS缓冲液重悬菌体，8000rpm转速离心5min，再重复清洗，最终收集湿菌体，（10）全细胞催化合成木糖醇：称取2‑3g湿菌体与20‑30mL中和后的浓缩液混和，将菌体打散，再加入50μL0.5mol/L的NADPH，置于50mL三颈烧瓶中，置于30‑35℃水浴中，400‑500rpm搅拌反应3‑4h。