[发明专利]固定化酶催化法制备D-核酮糖

摘要

本发明公开了固定化酶催化法制备D‑核酮糖，该方法先扩增、发酵生产D‑核酮糖代谢途径中所需的系列酶，接着对酶做纯化和固定，再加入起始原料，合成D‑核酮糖。本发明方法采用系列酶连续地将D‑葡萄糖酸转化成2‑氧‑D‑葡萄糖酸、3‑氧‑D‑葡萄糖酸、3‑氧‑D‑葡萄糖酸‑6‑磷酸以及D‑核酮糖‑5‑磷酸，比较完全地将D‑葡萄糖酸一步转化成最终产物。并通过在反应体系引入乳酸脱氢酶与丙酮酸，ATP再生酶与多聚磷酸，则能循环再生辅酶，从而有效降低这些昂贵的辅酶的用量。

主权项

1.一种制备D-核酮糖的方法，其特征在于包括以下步骤：/n(1)PCR扩增D-葡萄糖酸脱氢酶(GDH)、酮酸异构酶(GIS)、酮酸激酶(GK)、酮酸脱羧酶(GDC)、乳酸脱氢酶(LDH)、ATP再生酶(PPK)和磷酸水解酶(AP)的基因片段，将所得基因片段分别连接到质粒上，转入细胞中；细胞做抗性筛选，然后逐级扩大培养并诱导蛋白表达，分别收集含有上述各种酶的湿细胞；/n(2)将收集的湿细胞高压破碎、离心，在上清液中逐量加入硫酸铵直至蛋白固体析出；离心收集蛋白，纯化，分别得到GDH、GIS、GK、GDC、LDH、PPK、AP液体酶；/n(3)将GDH、GIS、GK、GDC的纯化混合酶溶解在缓冲液中，随后加入环氧树脂，室温搅拌2-6小时，将酶固定在环氧树脂上；LDH、PPK、AP的纯化酶依同样的步骤单独固定；/n(4)在缓冲液中加入D-葡萄糖酸钠、丙酮酸钠、三磷酸腺苷二钠盐、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸单钠盐、多聚磷酸、氯化镁和氯化钾，调节体系pH值到6.5-9.0，固定化混合酶、固定化LDH、固定化PPK一次性加入反应体系中，25-40℃反应直至反应完全，过滤回收固定化酶，所得D-核酮糖-5-磷酸粗液进行纯化；/n(5)将D-核酮糖-5-磷酸钠和六水氯化镁加入缓冲液中，再加入固定化AP，25-40℃反应1.5-3.0个小时，然后过滤回收固定化AP，反应液过阴离子交换树酯除去含磷酸杂质，D-核酮糖最先被洗脱出；最后经纯化得到D-核酮糖纯品。/n