[发明专利]固定化酶催化法合成D-木酮糖

摘要

本发明公开了固定化酶催化法合成D‑木酮糖，该方法从廉价的D‑木糖和D‑木糖醇出发，克隆了代谢途径中相关的系列酶基因，发酵生产系列酶，经过纯化和固定，然后加入相关起始原料，合成D‑木酮糖。本发明采用固定化酶法，以廉价的木糖和木糖醇为原料高收率转化成D‑木酮糖；通过与木酮糖激酶的偶合催化不仅实现了原料的转化完全，并且大大的方便了后期产品纯化，而固定化酶的应用则进一步降低了生产成本并有利于规模化工业生产。

主权项

1.一种合成D-木酮糖的方法，其特征在于包括以下步骤：/n(1)PCR扩增木糖异构酶、木糖醇氧化酶、木酮糖激酶、ATP再生酶、乳酸脱氢酶以及磷酸水解酶的基因片段，将所得基因片段分别连接到质粒上，转入细胞中；细胞做抗性筛选，然后逐级扩大培养并诱导蛋白表达，分别收集含有上述各种酶的湿细胞；/n(2)将收集的湿细胞高压破碎、离心，在上清液中逐量加入硫酸铵直至蛋白固体析出；离心收集蛋白，纯化，分别得到XI、XDH、XK、LDH、PPK、AP液体酶；/n(3)将XI、XK、PPK按活性单位比1.0:(1.5～3.0):(3.0～6.0)溶解在缓冲液中，随后加入环氧树脂，室温搅拌8小时以上，将酶固定在环氧树脂上；/n将XDH、XK、PPK、LDH四种酶按活性单位比(1.5-2.5):(1.5-3.0):(3.0-6.0):(1.0-2.0)混合，依上述同样的步骤固定在环氧树脂上；/nAP依上述同样的步骤单独固定；/n(4)在缓冲液中加入D-木糖、三磷酸腺苷二钠盐、多聚磷酸、氯化镁和氯化钾，调节pH值到6.5–8.5，加入固定化混合酶(XI、XK、PPK)，维持体系pH值在6.5-8.5，30℃搅拌3-5小时，过滤回收固定化酶，所得D-木酮糖-5-磷酸粗液进行纯化；/n在缓冲液中加入D-木糖醇、丙酮酸钠、三磷酸腺苷二钠盐、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸单钠盐、多聚磷酸、氯化镁和氯化钾，调节pH值到6.0-9.0，加入固定化混合酶(XDH、XK、LDH、PPK)，维持体系pH值在6.0-9.0，30℃搅拌2.5-5.5小时，过滤回收固定化酶，所得D-木酮糖-5-磷酸粗液进行纯化；/n(5)将D-木酮糖-5-磷酸钠和氯化镁加入缓冲液中，再加入固定化AP，20-40℃反应1.5-3.5个小时，然后过滤回收固定化AP，反应液过阴离子交换树酯除去含磷酸杂质，D-核酮糖最先被洗脱出；最后经纯化得到D-木酮糖纯品。/n