[发明专利]利用dU耐受型高忠实性DNA聚合酶的基因克隆方法在审
| 申请号： | 201910787162.7 | 申请日： | 2019-08-25 |
| 公开（公告）号： | CN110564754A | 公开（公告）日： | 2019-12-13 |
| 发明（设计）人： | 袁慧;田文奇 | 申请（专利权）人： | 苏州博睐恒生物科技有限公司 |
| 主分类号： | C12N15/70 | 分类号： | C12N15/70;C12N15/66;C12R1/19 |
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| 地址： | 215300 江苏省苏*** | 国省代码： | 江苏;32 |
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| 摘要： | 本发明公开了一种利用dU耐受型高忠实性DNA聚合酶的基因克隆方法，包括步骤为：用dU修饰引物和dU耐受型高忠实性DNA聚合酶扩增目标基因和质粒载体；用尿嘧啶DNA糖苷酶处理，再进行碱裂解，得到3’端为单链的DNA产物；将产物混合，使目标基因和质粒载体的两端单链区发生配对连接起来，形成含目标基因的带缺口环状重组质粒载体；含目标基因的带缺口环状重组质粒载体转化大肠杆菌后，缺口被修复好，得到含目标基因的完整重组质粒载体。通过上述方式，本发明能用于基因工程领域，特别是重组DNA的构建与氨基酸定点突变方面的应用，同时本方法也可用于需要进行DNA文库构建的精准医疗、基因克隆等领域。 | ||
| 搜索关键词： | 目标基因 重组质粒载体 基因克隆 缺口环状 质粒载体 构建 耐受 尿嘧啶DNA糖苷酶 基因工程领域 大肠杆菌 产物混合 定点突变 配对连接 修饰引物 重组DNA 单链区 碱裂解 氨基酸 单链 可用 扩增 修复 医疗 转化 应用 | ||
【主权项】：
1.一种利用dU耐受型高忠实性DNA聚合酶的基因克隆方法，其特征在于，包括步骤为：（1）用dU修饰引物和dU耐受型高忠实性DNA聚合酶扩增目标基因和质粒载体，得到目标基因PCR产物和质粒载体PCR产物；（2）将目标基因PCR产物和质粒载体PCR产物用尿嘧啶DNA糖苷酶处理，再进行碱裂解，使目标基因和质粒载体的两端产生12-30bp 单链同源区域；（3）将步骤（2）得到的产物混合，使目标基因和质粒载体的两端单链区发生配对连接起来，形成含目标基因的带缺口环状重组质粒载体；（4）步骤（3）得到的含目标基因的带缺口环状重组质粒载体转化大肠杆菌后，所述含有目标基因的重组质粒载体的缺口被修复好，得到含目标基因的完整重组质粒载体。/n
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