[发明专利]由胎盘间充质干细胞简易制备细胞因子的方法

摘要

本发明涉及由胎盘间充质干细胞简易制备细胞因子的方法。一方面，涉及从胎盘间充质干细胞中分离提取外泌体和细胞因子的方法，包括如下步骤：培养胎盘间充质干细胞获得培养上清；将培养上清经葡聚糖凝胶柱层析得到层析液；使用切向流超滤系统对层析液进行浓缩，得到外泌体浓缩液，同时得到的超滤过滤液再次使用切向流超滤系统对层析液进行浓缩进行过滤浓缩细胞因子浓缩液；将外泌体浓缩液或细胞因子浓缩液冷冻保存或者冷冻干燥。还涉及制备细胞因子浓缩液的方法。本发明方法呈现如说明书所述优异性质。

主权项

1.从胎盘间充质干细胞中分离提取外泌体和细胞因子的方法，该方法包括如下步骤：/n1)提供处于对数生长期的第2～5代人胎盘间充质干细胞，以5000～15000/cm²的密度接种至包含2mM的L-谷氨酰胺的DMEM/F12培养基中培养，培养3-4天后，收集上清，以20000g离心力离心20min除去细胞以及碎片，再经0.22μm滤膜过滤，得到培养上清；/n2)将Pudex葡聚糖凝胶过滤介质Pudex G-25用玻璃棒引流导入层析柱中，边装边用玻璃棒搅拌；/n3)装好柱后，用移液枪将柱子中上面的水吸出，再将步骤1)收集的培养上清加载到层析柱中；/n4)盖上层析柱的上盖，将上盖的细管插入到盛有双蒸水的烧杯中，打开恒流泵和收集器装置，调节恒流泵的速度和收集器时间，开始洗脱并收集包含细胞分泌物的洗脱馏份，作为层析液；/n5a)使用切向流超滤系统(例如仕必纯KR2i型切向流超滤系统)对层析液进行浓缩，用超纯水冲洗管路，安装100kD 100cm²的MidiKros过滤器，对步骤4)所得层析液5L进行过滤浓缩，得到100ml浓缩50倍的回流液为外泌体浓缩液，同时得到超滤过滤液；/n5b)重新安装1kD 100cm²的MidiKros过滤器，对步骤5a)所得超滤过滤液进行过滤浓缩，得到100ml浓缩50倍的回流液为细胞因子浓缩液；任选的6)将外泌体浓缩液分装，在-80℃条件冷冻保存；或者向外泌体浓缩液中添加冻干赋形剂后冷冻干燥；另外，将细胞因子浓缩液分装，在-80℃条件冷冻保存；或者向细胞因子浓缩液中添加冻干赋形剂后冷冻干燥。/n