[发明专利]一种筛选获得极短序列核酸适配体的方法

摘要

本发明公开了一种筛选获得极短序列核酸适配体的方法，在SELEX筛选方法基础上，结合高通量测序技术，对每轮SELEX筛选出的寡核苷酸文库都进行高通量测序，通过统计分析每个随机文库对应的高频序列数，进而对随机文库的随机序列进行增减，并通过循环逼近法最终获得最短的适配体序列。通过构建不同的筛选文库，采用高通量测序逼近的方法来获得极短序列的核酸适配体，省去了后期截短加工和改造的麻烦。

主权项

1.一种筛选获得极短序列核酸适配体的方法，其特征在于，包括如下步骤：/n（1）合成随机寡核苷酸文库：合成一个两端有固定序列、中间为随机序列的随机寡核苷酸文库，两端固定序列用于与引物结合进行PCR扩增；中间随机序列碱基数目为N，5≤N≤35，N为正整数；/n（2）结合：将随机寡核苷酸文库与靶目标相结合；/n（3）分离：分离出与靶目标结合的寡核苷酸；/n（4）PCR扩增：对分离出的能与靶目标结合的寡核苷酸进行PCR扩增，PCR产物一部分用作下一轮筛选的寡核苷酸文库，另一部分用于后续第（5）步的高通量测序；/n（5）高通量测序：对PCR扩增出的寡核苷酸文库进行高通量测序，选择出现次数或频率大于或等于2次的非引物序列的高频寡核苷酸序列，即为第1轮SELEX筛选的候选序列；/n（6）重复循环筛选：选择第4步扩增出的寡核苷酸文库，与靶目标结合，重复步骤（2）-（5），获得第2轮SELEX筛选的的候选序列；重复循环m次，其中1≤m≤10，获得m轮的SELEX筛选的候选序列；统计第1轮到第m轮的候选序列，用k表示累计获得的高频的候选序列数量；/n当筛选过程中出现下列情形时，/n①如果初始随机文库中的中间随机序列数量为N，当重复筛选的循环数m满足条件1≤m≤10，且候选序列的数量k满足条件0≤k<5时，继续进行m+1轮的重复（2）—（6）的步骤循环筛选；/n②如果初始随机文库中随机序列数量为N，当循环数m满足1≤m≤10，且高频序列的数量k≥5时，停止筛选；重新合成中间随机序列数为N-1的初始随机文库，以该初始随机文库为起点，按步骤（2）-（6）进行新的SELEX筛选；/n③如果初始随机文库中随机序列为N，当循环数m>10，且k=0时，即完成了10轮循环筛选后，高频序列的数量k仍然为零，即没有发现高频序列，则停止筛选；重新合成中间随机序列数为N+1的初始随机文库；再以这个N+1的新的随机文库为初始文库，按步骤（2）-（6）进行新的SELEX筛选；如果之前已经对随机序列为N+1的初始随机文库进行过筛选，且获得了一定数量的高频序列，则这些高频序列就是所要的极短序列，无需再进行筛选；全部筛选结束；/n④如果初始随机文库中随机序列为N，当循环数m>10，且高频序列的数量k≥1时，则停止这次筛选，重新合成中间随机序列数为N-1的初始随机文库，再按步骤（2）-（6）进行新的SELEX筛选；如果已经对随机序列为N-1的初始随机文库进行过了筛选，且没有获得高频序列，则停止全部筛选，这次筛选获得的k个高频序列就是所要的极短序列；全部筛选结束。/n