[发明专利]一种对犬类基因位点集合数据库

摘要

本发明公开了犬类基因位点合集技术领域的一种对犬类基因位点集合数据库，本合集是针对犬类而综合调研的基因位点合集，其中共包括位于Canfam 3.1基因序列上的50811个单核苷酸多态性位点(SNP)与插入缺失(Indels)，其所属基因与犬类血统祖源、外貌性状、遗传病风险三大方面具有显著联系。通过对犬类进行二代基因测序并将结果与本基因位点合集进行比对分析，即可预测出受检犬只的血统分布、外貌(如毛色，耳朵形状等)、性格、遗传病风险等表型。

主权项

1.一种对犬类基因位点集合数据库，其特征在于：/n具体技术方案：/n1.)选定合适的参考基因序列，慧宠选用了最新版本的Can Fam 3.1序列为参考序列。/n2.)搜集与犬类基因测序相关的文献，搜索关键词包括如【Canine GenomeSequencing】、【Canine Ancestry Gene】、【Canine Hereditary Disease Gene】等。记录每篇适用文献所记载的测序序列、序列版本、位点信息、受检犬只相关表型。/n3.)收集实体样本(犬口腔上皮细胞)进行上机测序。主要用途有两部分，/n一：通过真实样本验证文献中所提及的位点与表型的相关性，对于和实际测试中没有显著关联的位点进行过滤。/n二：补充文献上不曾报道测序过的犬种类，如藏獒，美国恶霸犬等，通过增添这些种类的数据来提高整个基因合集(特指血统祖源方面)的完整度。/n4.)样本分析流程如下：/na.使用口腔拭子采集目标犬只的口腔上皮细胞样本，并记录受检犬只的各项表型信息。/nb.对收集样本进行DNA提取，此流程采用CommaXP Swab DNA Kit试剂盒，具体操作依照操作指南执行。/nc.使用二代测序技术对DNA样本进行上机测序，获得样本的基因序列raw data。/nd.原始数据与本位点集合数据库进行比对，即callvariant,比对后得到该样本的变异位点数据。/ne.其位点变异位点进一步与本数据库进行注释比对，即annotation，最终得到该样本中的位点变异相关的表型信息。/n5.)构建数据库文件，按照统一格式录入筛选好的位点信息，并且添加数据库管理日志，对每一次数据库的添加/删改等操作进行记录。/n6.)收录的位点数据库中每一条数据共包含以下几种条目：/n位点染色体坐标、所属基因、变异模式、参考序列、对应表型、遗传模式、旁侧序列、等位基因。/n截至2019年8月，本位点数据库已收录与血统祖源相关位点50398个，遗传病相关位点共159个，外貌特征相关位点200个，行为性状相关位点46个，用药安全8个，本位点数据库将持续整理更新。/n基因序列说明：A、C、G和T分别代表组成DNA的四种核苷酸——腺嘌呤，胞嘧啶，鸟嘌呤，胸腺嘧啶，每个字母代表一种碱基，两个碱基形成一个碱基对，碱基对的配对规律是固定的，即是：A-T,C-G，典型的他们无间隔的排列在一起，例如序列AAAGTCTGAC，任意长度大于4的一串核苷酸被称作一个序列。/n所用到的DNA提取试剂来自于CommaXP Swab DNA Kit试剂盒，其具体组成与操作如下：/n试剂盒组成：/n /n该工艺包括如下步骤：/n步骤一：实验准备/na：第一次使用前，Buffer PD、Buffer PW中加入指定体积的无水乙醇；/nb：准备无核酸和核酸酶污染的Tip头、离心管；/nc：准备10mg/ml的RNase A、Poly Carrier RNA(1μg/μl)；/nd：使用前，观察溶液是否出现沉淀，若Buffer GL中有沉淀，可以在56℃水浴中加热溶解并冷却至室温后再使用；/n步骤二：将在面颊内擦拭过的棉签置于2ml离心管中，用剪刀将棉签部分从其杆上剪下，加入300μl Buffer SA，涡旋振荡15sec，加入400μl Buffer GL，涡旋振荡至彻底混匀，然后加入20μl Proteinase K溶液，涡旋10sec混匀，65℃水浴放置20min，期间每隔5min振荡混匀。/n注意：如需无RNA污染的基因组DNA，可加入少量RNase A溶液，振荡15sec，室温放置5min。/n步骤三：简短离心后，吸取400μl上清，加入等体积的Buffer GB充分颠倒混匀，65℃放置15min，期间每隔5min振荡混匀。/n步骤四：加入Buffer GB时可能会产生白色沉淀，一般65℃放置时会消失，不会影响后续实验。/n步骤五：加400μl无水乙醇，充分颠倒混匀，简短离心以除去离心管盖内壁的液滴。/n注意：加入无水乙醇后可能会出现絮状沉淀，但不影响DNA提取。/n步骤五：将上一步所得溶液分两次都加入一个吸附柱C5中(吸附柱C5已放入2.0mL收集管中)，12,000rpm(～13,400×g)离心30sec-1min，弃废液，将吸附柱C5重新放回收集管中。/n步骤六：向吸附柱C5中加入500μl Buffer PD(使用前请先检查是否已加入无水乙醇)，12,000rpm(～13,400×g)离心30sec-1min，弃废液，将吸附柱C5重新放回收集管中。/n步骤七：向吸附柱C5中加入600μl Buffer PW(使用前请先检查是否已加入无水乙醇)，12,000rpm(～13,400×g)离心30sec-1min，弃废液，将吸附柱C5重新放回收集管。/n步骤八：重复步骤6。/n步骤九：12,000rpm(～13,400×g)离心2min，弃废液。将吸附柱C5室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。/n注意：这一步的目的是将吸附柱中残余的漂洗液去除，漂洗液中乙醇的残留会影响后续的酶反应(酶切、PCR等)实验。/n步骤十：将吸附柱C5转入一新的1.5ml收集管中，向吸附膜中间位置悬空滴加30-80μlBuffer TE，室温放置2-5min，12,000rpm(～13,400×g)离心2min，收集DNA溶液。/n注意：洗脱缓冲液Buffer TE体积不应少于30μl，体积过小影响回收效率。为提高基因组DNA的得率，可将离心得到的溶液再加入吸附柱C5中，12,000rpm(～13,400×g)离心2min。/n