[发明专利]不同浓度α-MSH处理黑色素细胞后Gnαq基因表达特性的试验方法

摘要

本发明公开了不同浓度α‑MSH处理黑色素细胞后Gnαq基因表达特性的试验方法，步骤包括：黑色素细胞的分离与纯化；引物设计及合成；不同浓度α‑MSH处理黑色素细胞后总RNA提取及鉴定；反转录与目的片段扩增；PCR扩增产物纯化与回收；Gnαq cDNA序列测定；重组质粒的转化；质粒DNA提取；不同浓度α‑MSH处理黑色素细胞后Gnαq mRNA qRT‑PCR检测；不同浓度α‑MSH处理黑色素细胞后Gnαq蛋白水平检测；数据处理与统计分析。本发明通过分离纯化绵羊黑色素细胞，不同浓度α‑MSH处理，Real time PCR检测和WB检测结果显示，不同浓度α‑MSH处理黑色素细胞后，Gnαq基因的表达量呈降低趋势，α‑MSH对于Gnαq基因的表达不具有促进作用。因此，本发明验证了Gnαq基因对于黑色素的调控和α‑MSH不属于同一信号通路有关，作用机制得到了证实。

主权项

1.不同浓度α‑MSH处理黑色素细胞后Gnαq基因表达特性的试验方法，其特征在于，实验材料包括绵羊黑色素细胞取自3月龄黑色绵羊皮肤，包括如下步骤：S1：黑色素细胞的分离与纯化绵羊黑色素细胞取自3月龄黑色绵羊皮肤，黑色素细胞的分离与纯化采取羊驼黑色素细胞分离纯化的方法进行；S2：引物设计及合成根据NCBI网站提供的参考序列，使用Primer 5.0软件设计2对特异性引物用于荧光定量PCR，交公司进行合成；S3：不同浓度α‑MSH处理黑色素细胞后总RNA提取及鉴定不同浓度α‑MSH处理黑色素细胞总RNA提取及鉴定方法如下：1.5mL离心管中加入1,000μL RNAiso Plus，旋涡震荡30s，室温条件下放置5～10min；4℃ 12,000r/min离心5min；加入200μL氯仿，放置5‑10min；4℃12,000r/min离心15min，液面分为三层：液相、蛋白质、多余的氯仿；吸取上层液相，转移到1.5mL新离心管中，加入200μL异丙醇(IPA)，静置10min，4℃ 12,000r/min离心15min；倒掉上清液，白色沉底即为总RNA，加入1mL 75％乙醇，悬浮白色沉淀，4℃ 12,000r/min离心5min，倒掉上清液，干燥5‑10min，加入30‑50μL RNase‑free水，彻底溶解总RNA；S4：反转录与目的片段扩增使用PrimeScriptRT Master Mix Perfect Real Time kit试剂盒进行反转录；S5：PCR扩增产物纯化与回收紫外灯下观察琼脂糖凝胶，将目的条带由凝胶切下，放入预先称重的离心管中，称重并计算凝胶质量；按每100mg凝胶加入300μL的溶胶液，60℃水浴10min，期间多次振荡混匀，直至凝胶完全融化；加入等体积异丙醇，静置至室温，取700μL胶溶液加入吸附柱中，静置2min；室温以10,000g离心1min，弃穿透液；于吸附柱中加入700μL漂洗液，室温以10,000g离心1min，弃穿透液；再加入500μL漂洗液，室温以10,000g离心1min，弃穿透液；10,000g离心2min，去除残留的漂洗液；将吸附柱转至新离心管，室温下开盖静置2min，加入50μL预热的洗脱液，室温放置5min；10,000g离心1min，管中溶液即为回收产物；S6：Gnαq cDNA序列测定按照pEASY‑T1 Cloning Vector试剂盒使用说明将回收出来的DNA片段连接至pEASY‑T1 Cloning‑Vector，混匀，离心，室温反应15min；S7：重组质粒的转化取5μL连接产物，加入50μL的DH5α大肠杆菌感受态细胞，轻弹混匀，冰浴30min；42℃热激60s，立即冰上冷却2min。将混合物加入500μL的无抗生素LB液体培养基，37℃ 180r/min复苏45min；混匀菌液，于超净台中吸取100μL加入含抗生素的LB固体培养基，均匀涂开，封口后37℃倒置培养12h；挑取目标单菌落，加入50mL含抗生素的LB液体培养基，于摇床37℃ 180r/min培养12h；S8：质粒DNA提取将100μL新鲜菌液接种到15‑50mL含抗生素的LB培养基中，37℃震荡培养14‑16h；室温下，5,000g离心10min，收集菌体；倒去上清液，加入2.5mL Buffer A1；加入2.5mL Buffer B1，静置5‑10min至裂解液变得清亮粘稠；加入1mL Buffer N3，混合均匀；将裂解液加入到滤器式注射器中，注射器插入到50mL圆锥形离心管中，室温静置10min，轻轻地插入活塞，排出澄清的裂解液至新的离心管中；加入1倍体积Buffer RET和3mL100％无水乙醇，混合均匀；转移裂解液/乙醇混合物至50mL DNA柱中，用活塞将裂解液排出；加入10mL DNA Wash Buffer，用活塞将Buffer废液完全排出；将中提DNA柱子拆下，插入到2.0mL的EP管中；将DNA柱13,000‑15,000r/min离心1min，轻轻将废液倒出，把DNA柱重新放回到EP管中，离心2min；加入500μL Endofree Elution Buffer至DNA柱中心，室温静置1min，12,000r/min离心1min洗脱DNA；再加入300μL Endofree Elution Buffer，室温静置1min，12,000r/min离心1min洗脱DNA，将质粒送测序；S9：不同浓度α‑MSH处理黑色素细胞后Gnαq mRNA qRT‑PCR检测不同浓度α‑MSH处理黑色素细胞后Gnαq mRNA qRT‑PCR检测；S10：不同浓度α‑MSH处理黑色素细胞后Gnαq蛋白水平检测提取不同浓度α‑MSH处理黑色素细胞总蛋白，蛋白提取试剂加入之前，先加入苯甲磺酰氟，在4℃温育30min后，将样品在4℃以12,000×g离心10min，收集上清液，使用BCA法测定总蛋白浓度标准测量，使用SDS‑聚丙烯酰胺凝胶分离总蛋白，使用4.0％分离胶和10％的浓缩凝胶，80V 30min和120V 2.0h，蛋白电泳结束后，120mA恒流电泳45min，将蛋白湿转到硝酸纤维素膜上，5％BCA封闭液封闭1h，将封闭后的NC膜与一抗rabbit anti‑sheep‑Gnαq(1∶1667)和内参rabbit anti‑β‑actin antibody(1∶300)37℃温育2h，加入二抗donkey anti‑rabbit IgG(1∶10,000)，室温下孵育1h，使用TBST，将膜洗涤3次，滴加eECL Western Blot化学发光试剂，FluoChemQ对凝胶图像采集和分析，所有试验均重复3次；S11：数据处理与统计分析所有数据使用SPSS 17.0软件进行分析，统计分析基于ANOVA，Duncan方法进行多重比较，使用SigmaPlot 12.5对数据转换成图表处理，结果用平均值±标准误差表示。