[发明专利]一种抗过敏肽及其制备方法

摘要

本发明公开了一种抗过敏肽及其制备方法，包括如下步骤：S1、大西洋鲑内脏酶解产物的制备：将12％底物在蒸馏水（w/v）和胃蛋白酶中混合，然后使用1M HCl将pH调节至2.0，37℃保温8 h释放抗过敏肽，100℃加热15 min灭活胃蛋白酶，冷却后，使用0.45μm滤膜进行抽滤，去除未水解的蛋白质。本发明采用酶解技术对大西洋鲑副产物进行酶解处理，采用不同的体外评价方法以及连续色谱技术制备纯化出具有抗过敏作用的活性肽并鉴定。实现了将工业鱼副产物和活性肽有机地结合起来，在拟获取抗过敏活性肽的同时为工业鱼下脚料加工处理开辟了新的高值充分利用道路，使之在抗过敏领域发挥作用。

主权项

1.一种新型抗过敏肽及其制备方法，其特征在于，包括如下步骤：/nS1、大西洋鲑内脏酶解产物的制备：将12％底物在蒸馏水（w/v）和胃蛋白酶中混合，然后使用1M HCl将pH调节至2.0，37℃保温8 h释放抗过敏肽，100℃加热15 min灭活胃蛋白酶，冷却后，使用0.45μm滤膜进行抽滤，去除未水解的蛋白质，将酶解液清液冻干并保存于-20℃直至使用；/nS2、抗过敏活性测定：取4个EP管，分别标上A、B、C、D，之后步骤如下：A、B管加入100L缓冲液，C、D管加入100μL样品液，A、C管加入50μL透明质酸酶液，B、D管加入50μL缓冲液，37℃孵育20min后，加入20μL 2.5mol/L CaCl₂溶液，37℃孵育20min，然后在各管加入50μL透明质酸，100μL缓冲液，250μL去离子水，37℃孵育40min，室温放置10min，之后在每管加入110μL碱性硼酸盐溶液，沸水加热5min终止反应，冰水浴20min，最后在每管加入1.5ml p-二甲氨基苯甲醛，37℃孵育20min，于585nm处测定吸光值，并计算出抑制率；/nS3、抗过敏肽初步分离纯化研究：以透明质酸酶抑制率为抗过敏指标，探究不同分子量的肽段的抗过敏活性，采用两种不同的超滤膜（MW10.0，3.0 kDa）将目标水解液分成了三个组分Ⅰ, Ⅱ, Ⅲ，分别为Ⅰ（MW>10Kda），Ⅱ（3Kda<MW<10Kda），Ⅲ（MW<3Kda），各组分显示出不同的抗过敏活性，其中Ⅲ（MW<3.0 kDa）组分过敏活性最强，对透明质酸酶活性的抑制率高达66.24%，选用Ⅲ进行进一步分离纯化；/nS4、凝胶层析分离纯化抗过敏肽:采用Sephadex G-15 葡聚糖凝胶层析对组分Ⅲ进行进一步的分离纯化，采用 Sephadex G-15 作为凝胶填料，将其进行预处理后装于规格为16×900mm 的玻璃层析柱中，在1 ml/min的流速下用超纯水进行洗脱，于214nm 处检测并收集各洗脱峰对应的洗脱溶液，冷冻干燥后测定各组分的抗过敏活性，选择抗过敏活性最强的组分进行下一步的纯化；/nS5、反相高效液相色谱分离纯化抗过敏肽:将样品（10 mg/ml）用0.22μm注射器过滤，样品自动注入安捷伦反相高效液相色谱柱（Pursuit 10 C₁₈，250×21.2mm），进一步纯化，以1.0 mL/min的流速进行分离，得到 C1-C6六个组分，线性梯度为0-50%洗脱液B，分离时间为25 min，在215 nm处检测各组分的洗脱峰，收集透明质酸酶抑制活性最强的峰并冻干；/nS6、LC-MS/MS鉴定抗过敏肽：利用 LC-MS/MS对S5中抗过敏性最高的组分进行鉴定，得到一序列为TPEVHIAVDKF，MH+为1255.67Da经合成后验证具有抗过敏作用的肽段，通过对该鉴定出的序列TPEVHIAVDKF进行化学合成，然后采用抗DNP-IgE/DNP-BSA体系构建RBL细胞致敏-激发模型，测定合成肽对RBL细胞脱颗粒释放β-氨基己糖苷酶（β-HEX）的抑制效果，通过测定β-HEX在培养基中的释放，评价纯化肽的抗过敏作用。/n