[发明专利]自噬基因Beclin-1在家兔激素股骨头缺血坏死中的表达方法

摘要

自噬基因Beclin‑1在家兔激素股骨头缺血坏死中的表达方法，利用HE染色计数空缺骨陷窝,透射电镜检测骨细胞、成骨细胞自噬型细胞死亡情况，RT‑PCR、western blotting检测Beclin1的mRNA与蛋白表达,免疫荧光检测GFP‑Beclin1蛋白表达；并通过给实验组动物注射3‑MA(3‑Methyladenine,3‑甲基腺嘌呤)来调控这一生物学过程,进一步探讨SANFH的发病机制。结果RT‑PCR:SANFH组的Beclin1 mRNA呈高表达,3‑MA治疗组中骨细胞的Beclin1 mRNA表达量较SANFH组均降低。Western Blot:第一周、第二周SANFH组中Beclin1蛋白高表达,3‑MA治疗组中Beclin1蛋白表达明显下降。免疫荧光染色:SANFH组中骨细胞、成骨细胞的GFP‑Beclin1融合蛋白表达均较对照组升高，给予3‑MA后可以部分减弱GFP‑Beclin1融合蛋白表达。

主权项

1.自噬基因Beclin-1在家兔激素股骨头缺血坏死中的表达方法，其特征在于，包括如下步骤：/n步骤一、造模：取5月龄日本大耳白兔36只，体重2.5-3.5kg，标准饮食，单笼饲养；随机分成3组；对照组：单纯肌肉注射生理盐水，2ml/只/次，共4次，间隔一周；SANFH组:肌肉注射甲基强的松龙，4mg/kg，共4次，间隔一周；3-MA治疗组：肌肉注射甲基强的松龙，4mg/kg，共4次，间隔一周，并于注射甲基强的松龙后随即肌肉注射3-MA2ul/只，共4次，间隔一周；分别将每组实验动物于一周、二周、三周、四周处死，每次处死3只；/n步骤二、标本制作，造模一周、二周、三周、四周后采用耳缘静脉注射空气的方法分别处死实验动物，每次处死3只，相对无菌条件下取出实验动物双侧后肢的股骨头；取一侧股骨头分为三部分进行显微镜观察；另一侧股骨头于-80℃冷冻保存，用于进一步检测Beclin1mRNA与蛋白表达；/n步骤三、光镜下组织形态学观察/n取石蜡包埋组织块，制成厚4um切片，HE染色，之后将实验切片在光镜下观察，计算空缺骨陷窝百分比；正常空缺骨陷窝率为8％-12％，同等制片条件下股骨头软骨下空缺骨陷窝率超过此数目即提示坏死；/n步骤四、透射电镜观察自噬体/n包括：(1)固定脱钙；(2)在20℃的条件下对透射电镜标本进行梯度酒精脱水；(3)渗透；(4)包埋聚合；(5)利用LeicaEMUC6超薄切片机制作超薄切片，经染色等处理后在FEITECNAISPIRIT透射电镜下进行标本的观察、分析并摄片；/n步骤五、RT-PCR检测细胞内Beclin1 mRNA水平/n包括如下步骤：/n(1)组织mRNA的抽提；/n(2)引物设计；/nGC含量接近45-55％，上下游引物GC含量要保持接近的原则设计引物；选择长度为18-27bp之间，5'端GC含量较多，3'端AT含量较多的引物；以公式Tm＝4*(G+C)+2*(A+T)-5计算Tm值，Tm接近72℃；最终得到Beclin1的上游引物序列为5’-ATCCTGGACCGTGTCACCATCCAGG-3’，下游引物序列为5’-GTTGAGCTGAGTGTCCAGCTGG-3’，目的片段为363bp；β-Actin的上游引物序列为5’-ACTCGTCATACTCCTGCT-3’，下游引物序列为5’-GAAACTACCTTCAACTCC-3’，目的片段132bp；/n(3)逆转录cDNA；/n1)取模板RNA及解冻试剂，涡旋混匀，离心后收集残留于管壁的液体，置于冰上；/n2)配制引物溶液：EP管3000rpm离心5分钟；每管加50μl RNase-Free ddH