[发明专利]自噬基因MAP1LC3在家兔激素性股骨头缺血坏死中的表达方法

摘要

一种自噬基因MAP1LC3在家兔激素性股骨头缺血坏死中的表达方法，使用激素诱导出激素性股骨头缺血坏死动物模型，检测激素对骨细胞、成骨细胞MAP1LC3的mRNA与蛋白高表达影响；探讨3‑甲基腺嘌呤，调控骨细胞、成骨细胞自噬型死亡以及骨细胞、成骨细胞MAP1LC3的mRNA与蛋白高表达，显示第一、二、三、四周时：B组的MAP1LC3 mRNA呈高表达,C组中骨细胞的MAP1LC3 mRNA表达量较B组均降低。第一、二周B组中MAP1LC3蛋白高表达,C组中MAP1LC3蛋白表达明显下降。免疫荧光染色:B组中骨细胞、成骨细胞的GFP‑LC3融合蛋白表达均较对照组升高，C组GFP‑LC3融合蛋白表达明显下降。激素导致SANFH模型中骨细胞、成骨细胞的自噬型细胞死亡；导致骨细胞、成骨细胞的MAP1LC3的mRNA与蛋白高表达。3‑MA抑制骨细胞、成骨细胞自噬型细胞死亡。

主权项

1.一种自噬基因MAP1LC3在家兔激素性股骨头缺血坏死中的表达方法，其特征在于，包括如下步骤：/n步骤一、选健康5月龄新西兰大耳白兔36只，体重2.0-2.5kg，雌雄不限，标准饮食，单笼饲养；随机分成3组，A组12只，为对照组，单纯肌肉注射生理盐水，2ml/只/次，共4次，间隔一周；B组12只，肌肉注射甲基强的松龙，4mg/kg，共4次，间隔一周；C组12只，肌肉注射甲基强的松龙，4mg/kg，共4次，间隔一周，并于注射甲基强的松龙后随即肌肉注射3-MA2μl/只，共4次，间隔一周；分别将每组实验动物于一周、二周、三周、四周后采用空气栓塞法处死，每次处死3只；/n步骤二、无菌条件下取出实验动物双侧后肢的股骨头：一侧股骨头分成两部分：①一部分经40﹪中性甲醛固定、脱水、15％EDTA脱钙、梯度酒精脱水，浸蜡包埋，制成5um厚切片,HE染色后光镜观察用；②另外一部分经5﹪戊二醛溶液固定,于股骨头软骨下0.2-0.3cm切取1mm×1mm×1mm大小骨块，5％硝酸脱钙2-3h，1％四氧化锇后固定1h，梯度酒精脱水，EPON812(环氧树脂)包埋，包埋剂与无水乙醇分别以1：1、2：1、3：1浓度混合逐层置换无水乙醇，包埋，37℃恒温箱24h浸透，60℃烤箱聚合48h，制备50nm超薄切片，醋酸双氧铀、柠檬酸铅双染色，供透射电镜、免疫荧光电镜观察；③另一侧股骨头分离提取骨细胞、成骨细胞，-80℃冰箱保存，进行MAP1LC3的mRNA与蛋白表达、自噬型细胞死亡检测；/n步骤三、光镜下组织形态学观察；/n1)取一洁净的小烧杯，并依次向里面加入一侧股骨头组织、10％EDTA脱钙液，并在液面上加一层液体石蜡，同时在小烧杯上加盖，然后放入微波炉中，调节微波温度为40℃～60℃间歇脱钙，1分钟/1次，即一个循环，每次循环结束后将烧杯放到室温冷却15分钟，并更换新液，脱钙时间为1分钟×20次/24小时×7次，以大头针能够刺进骨密质为完成脱钙标准；/n2)一侧股骨头经4％多聚甲醛溶液固定24h后，经各级乙醇脱水后用石蜡包埋，然后将石蜡包埋组织快制成厚4μm切片；/n3)将制成的切片按以后步骤进行染色并采用中性树胶封片；/n4)将中性树胶封片后的切片分别用100倍及400倍光学显微镜观察，激素性股骨头坏死判定标准是以股骨头软骨下区空缺骨陷窝率作为激素性股骨头坏死的组织学判定指标；用空缺骨陷窝率来表示骨细胞坏死的病理变化；/n步骤四、投射电镜观察：/n取5％戊二醛固定的股骨头组织，首先在股骨头软骨下切取长、宽、厚度各1-2mm大小组织，然后放入5％硝酸脱钙，脱钙时间2-3h，后用1％四氧化锇固定，固定时间1-2h，随后用梯度酒精脱水，再用环氧树脂包埋，然后用1份的包埋剂与1份的无水乙醇置换无水乙醇，再依次用2份的包埋剂与1份在无水乙醇替换，最后用3份的包埋剂与1份的无水乙醇替换，然后包埋，然后放入37℃恒温箱24h，再放入60℃烤箱48h，然后用超薄切片机制备50nm超薄切片，并用醋酸双氧铀+柠檬酸铅双染色；将上述超薄切片置于电子显微镜下观察；/n步骤五、RT-PCR检测细胞内LC3 mRNA水平/n1)细胞mRNA的提取/n2)引物设计：/nMAP1LC3的基因序列为：/n上游：5’-GATGTCCGACTTATTCGAGAGC-3’/n下游：5’-TTGAGCTGTAAGCGCCTTCTA-3’,/n扩增片段大小为363bp/n内参β-Actin的基因序列为：/n上游：5’-ACTCGTCATACTCCTGCT-3’，/n下游：5’-GAAACTACCTTCAACTC-3’，/n扩增片段大小为132bp；/n3)将mRNA逆转录成cDNA；/n4)mRNA的荧光定量PCR；/n步骤六、Western Blot鉴定蛋白表达量/n1)组织总蛋白的提取；/n2)SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳：SDS-PAGE；/n3)转膜和免疫发光过程；/n步骤七、免疫荧光染色；/n步骤八、统计处理：/n应用SPSS 13.0软件进行统计学分析，实验数据以