[发明专利]精确大片段基因删除结合终止密码子插入的基因敲除法无效
| 申请号： | 201910890379.0 | 申请日： | 2019-09-20 |
| 公开（公告）号： | CN110541001A | 公开（公告）日： | 2019-12-06 |
| 发明（设计）人： | 赵培;康雅虹;罗莹 | 申请（专利权）人： | 福建上源生物科学技术有限公司 |
| 主分类号： | C12N15/89 | 分类号： | C12N15/89;C12N15/90 |
| 代理公司： | 35219 福州市景弘专利代理事务所(普通合伙) | 代理人： | 林祥翔;郭鹏飞<国际申请>=<国际公布> |
| 地址： | 350004 福建省福州市台江区*** | 国省代码： | 福建;35 |
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| 摘要： | 本发明属于基因工程的基因编辑技术领域，更具体地涉及一种高效的基因敲除法，即精确大片段基因删除结合终止密码子插入的基因敲除法。本发明旨在解决目前基因精确敲除中长片段敲除的难度大、周期长的问题。首先确定5’sgRNA靶位点位于起始密码子附近(100bp以内)，3’端sgRNA靶位点位于5’端sgRNA靶位点与终止密码子之间任何位置，sgRNA靶位点的编辑效率分数高并且脱靶效应接近于0；其次确定被删除序列的5’和3’端点位于5’sgRNA靶序列和3’sgRNA靶序列中，修复模板带有终止密码子。最后将5’端上游sgRNA质粒和3’端下游sgRNA质粒与所述Cas9质粒、共编辑标记质粒、报告基因质粒和修复模板制得显微注射DNA混合液体系一起注入雌雄同体线虫体内，统计其基因编辑效率并验证筛选功能与全基因敲除法的一致性，发现本发明提供的技术方案基因编辑效率高、性价比好和成功率高的优点。 | ||
| 搜索关键词： | 靶位点 终止密码子 质粒 基因 靶序列 除法 敲除 删除 报告基因质粒 修复 插入的基因 大片段基因 基因敲除法 起始密码子 标记质粒 基因工程 任何位置 显微注射 长片段 全基因 线虫 成功率 体内 验证 筛选 上游 统计 发现 | ||
【主权项】：
1.一种精确大片段基因删除结合终止密码子插入的基因敲除法，其特征在于，包括以下步骤：/n准备Cas9质粒、共编辑标记质粒、报告基因质粒和雌雄同体线虫；/n确定5’和3’端sgRNA靶位点序列；/n确定和构建修复模板；/n构建5’端上游sgRNA质粒和3’端下游sgRNA质粒；/n配制显微注射DNA混合液：将所述5’端上游sgRNA质粒和3’端下游sgRNA质粒、所述Cas9质粒、共编辑标记质粒、报告基因质粒和修复模板混合得到所述显微注射DNA混合液；/n显微注射：将所述显微注射DNA混合液注射入雌雄同体线虫的性腺，得到P0代线虫，培养得到F1代线虫；以及/n筛选、验证目的突变。/n
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