[发明专利]基于ARTP复合诱变技术的高通量筛选庆大霉素高产菌株的方法有效
| 申请号： | 201910901453.4 | 申请日： | 2019-09-23 |
| 公开（公告）号： | CN110499308A | 公开（公告）日： | 2019-11-26 |
| 发明（设计）人： | 李敏超;李兰;张嗣良;庄英萍;储炬;杭海峰 | 申请（专利权）人： | 华东理工大学青岛创新研究院;华东理工大学 |
| 主分类号： | C12N15/01 | 分类号： | C12N15/01;C12Q1/04 |
| 代理公司： | 31225 上海科盛知识产权代理有限公司 | 代理人： | 褚明伟<国际申请>=<国际公布>=<进入 |
| 地址： | 266061 山东省青岛市崂*** | 国省代码： | 山东;37 |
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| 摘要： | 本发明涉及基于ARTP复合诱变技术的高通量筛选庆大霉素高产菌株的方法，包括孢子悬浮液制备、ARTP诱变复合诱变、快速检测产物、初筛庆大霉素高产菌株和复筛获得高产菌株保藏以及高产菌株稳定性考察的步骤。与现有技术相比，本发明利用OPA与庆大霉素发生反应形成在330nm左右形成特征吸收峰的原理，通过酶标仪实现快速测定OD值从而成功实现了庆大霉素快速检测。克服了常规采用磷钨酸法与庆大霉素形成的沉淀导致OD值下降的方法存在的专一性较差，发酵液颜色等干扰问题。本发明具有快速、高通量、操作便捷、准确等特点，很大程度上提高了庆大霉素诱变育种、筛选效率，使获得庆大霉素高产菌株的几率大大提高。 | ||
| 搜索关键词： | 庆大霉素 高产菌株 快速检测 复合诱变技术 高通量筛选 特征吸收峰 稳定性考察 孢子悬浮液 复合诱变 获得高产 快速测定 诱变育种 保藏 发酵液 高通量 磷钨酸 酶标仪 专一性 初筛 复筛 菌株 诱变 制备 沉淀 筛选 成功 | ||
【主权项】：
1.一种基于ARTP复合诱变技术的高通量筛选庆大霉素高产菌株的方法，其特征在于，包括以下步骤：/n第一步，孢子悬浮液制备：将成熟的工业生产菌株斜面上孢子或甘油管保藏的孢子接种于双碟培养基内，待孢子成熟后，取培养基上成熟的孢子转移至装有无菌生理盐水的离心管中制备孢子悬浮液，根据孢子量稀释不同梯度；/n第二步，ARTP诱变复合诱变：将不同梯度的孢子悬浮液加入诱变剂后，使用ARTP诱变仪产生的等离子流处理不同时间进行诱变，诱变完成后立即涂布于双碟培养基内，待孢子成熟后，将待筛选的工业生产菌株单菌落分别接种于装有斜面培养基和发酵培养基的深孔板中培养；/n第三步，快速检测产物：微孔板发酵培养4-5天后对发酵液调节pH至1.4-1.5，常温放置后离心，取上清加入OPA衍生剂，加水，然后水浴，待冷至常温后放置于孔板离心机上离心，取上清液转移到酶标板上，然后设定酶标仪在325nm下测定各发酵液的吸光度，根据标准曲线计算对应产物含量获得高产菌株；/n第四步：初筛庆大霉素高产菌株和复筛获得高产菌株保藏：将快速筛选得到的菌株转接至深孔板斜面培养基上长出的对应的高产菌株同时接种于大试管斜面或茄子瓶斜面并进行摇瓶发酵培养，发酵摇瓶培养结束后执行液相检测方法确定组分是否符合药典要求，如确认高产菌株则进行20-30％甘油管保藏菌种；/n第五步，高产菌株稳定性考察：大试管斜面或茄子瓶斜面连续传代五次并进行发酵摇瓶培养测定庆大霉素产量和组分，确定经过初筛和复筛而获得高产菌的遗传稳定性。/n
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