[发明专利]一种基于CRISPR技术定向遗传改造米曲霉基因的方法

摘要

本发明提供了利用一种可以在Aspergillus属真菌内进行自主复制的穿梭载体，并通过组成型启动子PgpdA启动表达cas9，定向遗传改造米曲霉基因的方法，该方法消除了载体插入位点和培养基组分对cas9表达的影响，提高了基因编辑效率，并且能够产生无标记(Marker‑Free)的米曲霉工程菌，免除对转基因的担忧，提高转基因改造米曲霉的实用性。

主权项

1.一种基于CRISPR技术定向遗传改造米曲霉基因的方法，其特征在于，包括以下步骤：/n1)以cas9序列为参考，人工合成cas9基因，其核苷酸序列为序列1所示的DNA分子；以上述人工合成的cas9基因为模板，以序列SEQ ID NO:1，SEQ ID NO:2的DNA片段为引物，执行PCR扩增获得的cas9 DNA分子重组连接到载体pEX1上，所述重组载体为将pEX1的XhoI和BamHI识别序列间的DNA替换为序列1所示的DNA分子得到的重组载体pEX1-cas9，pEX1-cas9重组载体含有由构巢曲霉基因gpdA基因启动子PgpdA，序列1所示的cas9基因，trpC基因终止子三部分组成的序列2所示的cas9蛋白表达盒，即PgpdA-cas9-TtrpC；/n2)以上述cas9蛋白表达盒PgpdA-cas9-TtrpC为模板，以序列SEQ ID NO:3，SEQ ID NO:4的DNA片段为引物，执行PCR扩增获得的cas9蛋白表达盒重组连接到载体pPTR II上。所述重组载体为在载体pPTR II的HindIII多克隆位点上插入PgpdA-cas9-TtrpC表达盒，得到重组载体pPTR II-cas9，其中载体pPTR II是一种可以在Aspergillus属真菌内进行自主复制的穿梭载体；/n3)以米曲霉RIB40基因组DNA为模板，以序列SEQ ID NO:5，SEQ ID NO:6的DNA片段为引物，执行PCR扩增获得序列3所示的U6启动子U6 promoter融合靶基因的向导序列，其中SEQID NO:6的DNA片段含有靶基因的向导序列，从而在该融合DNA分子3’端融合了靶基因的向导序列，形成U6 promoter+guide sequence的融合DNA分子；以向导RNA和U6终止子序列为参考，人工合成sgRNA融合U6终止子，其核苷酸序列为序列4所示的DNA分子，并以此为模板，以SEQ ID NO:7，SEQ ID NO:8的DNA片段为引物，执行PCR扩增获得序列4所示的sgRNA融合U6终止子，其中SEQ ID NO:7的DNA片段含有靶基因的向导序列，从而在该融合DNA分子5’端融合了靶基因的向导序列，形成guide sequence+sgRNA+U6 terminator的融合DNA分子；以上述扩增的U6promoter+guide sequence，guide sequence+sgRNA+U6 terminator融合DNA分子为模板，以SEQ ID NO:5，SEQ ID NO:8的DNA片段为引物执行重叠PCR扩增，获得的U6promoter+guide sequence+sgRNA+U6 terminator表达盒重组连接到载体pPTR II中，所述重组载体为在载体pPTR II的SmalI多克隆位点上插入U6 promoter+guide sequence+sgRNA+U6 terminator表达盒，得到重组载体pPTR II-cas9-guide sequence；/n4)米曲霉RIB40或3.042孢子接种到液体DPY培养基中，培养16-20h后收集菌丝，并用无菌水洗2次，用Yatalase酶法裂解上述菌丝，获取原生质体，将提取好的重组载体与原生质体混匀，加上60％PEG 4000进行原生质体转化，室温静置20min后，离心收集原生质体，并与含0.1μg/ml吡啶硫胺素，0.8％琼脂的MM培养基混匀，平铺在含0.1μg/ml吡啶硫胺素，1.5％琼脂MM培养基平板上，30℃培养3-4天；/n5)挑取上述MM培养基长出的菌丝，转移至含0.1μg/ml吡啶硫胺素的CD培养基上，进行二次筛选；/n6)选取上述长满菌丝的的CD平板，挑取菌丝，以SEQ ID NO:9，SEQ ID NO:10的DNA片段为引物执行PCR扩增，并对扩增产物进行测序，比对测序结果看是否在靶基因向导序列上发生突变