[发明专利]一种应用于马铃薯上的CRISPR/Cas9载体的构建方法在审
申请号: | 201910913593.3 | 申请日: | 2019-09-25 |
公开(公告)号: | CN110607322A | 公开(公告)日: | 2019-12-24 |
发明(设计)人: | 闫建俊;白云凤;左静静;左敏;李萌 | 申请(专利权)人: | 山西省农业科学院作物科学研究所 |
主分类号: | C12N15/82 | 分类号: | C12N15/82;A01H5/00;A01H6/82;A01H4/00 |
代理公司: | 44248 深圳市科吉华烽知识产权事务所(普通合伙) | 代理人: | 谢肖雄 |
地址: | 030000 *** | 国省代码: | 山西;14 |
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摘要: | 本发明公开了一种应用于马铃薯上的CRISPR/Cas9载体的构建方法,属于植物分子生物学领域。该方法包括如下步骤:根据马铃薯中糖苷生物碱合成关键酶基因PGA2设计用于基因敲除的gRNA靶点,合成引物gRNA,然后将gRNA和Cas9蛋白结合形成表达盒,再将表达盒插入到表达载体PCAMBIA 1300中,将得到的连接物转化到大肠杆菌中,摇菌测序后,构建用于遗传转化的农杆菌工程菌,转化马铃薯,提取基因组DNA,筛选出阳性植株。本发明首次在马铃薯作物中通过CRISPR/Cas9基因编辑技术对马铃薯中糖苷生物碱合成关键酶基因进行编辑,为后续基因功能研究或马铃薯基因工程育种等奠定技术基础。 | ||
搜索关键词: | 马铃薯 合成关键酶 糖苷生物碱 表达盒 构建 基因 植物分子生物学 提取基因组DNA 基因工程育种 基因功能研究 农杆菌工程菌 大肠杆菌 马铃薯作物 表达载体 蛋白结合 合成引物 基因敲除 技术基础 阳性植株 遗传转化 连接物 靶点 测序 转化 筛选 应用 | ||
【主权项】:
1.一种应用于马铃薯上的CRISPR/Cas9载体的构建方法,其特征在于,包括如下步骤:/nS1、CRISPR靶点设计:/n根据马铃薯PGA2基因序列号AB839753.1设计sgRNA:GGTGTGAAATCGTGGTGCAATGG;/nS2、利用同源重组的原理设计引物oligo:/n正向序列:5’-AGTCGAAGTAGTGATTGGGGTGTGAAATCGTGGTGCAA-3’,/n反向序列:5’-ATTTCTAGCTCTAAAACCTTGCACCACGATTTCACACC-3’;/nS3、引物gRNA的形成:/n将合成的引物oligo分别稀释成10μM,按如下比例混合,进行退火反应后形成引物gRNA;/n
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