[发明专利]一种检测血小板衍生生长因子BB的均相生物分析方法及其应用

摘要

一种检测血小板衍生生长因子BB的均相生物分析方法及其应用，利用两条核酸适配体S1和S2与PDGF‑BB之间的夹心识别反应，得到一种含有Mg2+核酸酶的功能核酸结构；再通过引入两个由G‑四链体DNA酶和另外一种Mg2+核酸酶的1/2劈开碱基序列组成的发夹结构DNA，以及连接DNA，利用Mg2+激活其核酸酶催化剪切作用来实现目标物循环及发夹结构中设计的G‑四链体DNA酶的双重放大释放；利用G‑四链体DNA酶的催化显色反应构建显色产物吸光度与PDGF‑BB分析物浓度之间的定量关系；本发明方法操作简单，成本低廉，灵敏度高，重复性好，对于临床诊断领域蛋白质标记物的方便、自动化检测具有十分重要的应用价值。

主权项

1.一种检测血小板衍生生长因子BB的均相生物分析方法，其特征在于包括以下步骤：/n（1）DNA链的高温退火处理/n取5个PV管并分别编号为#1、#2、#3、#4和#5，向每个PV管中加入190µL浓度为20mM pH=7.4的三羟甲基氨基甲烷缓冲溶液，所述缓冲溶液中含有100mM NaCl、10mMKCl和10mMMgCl₂；/n接着向#1PV管中加入10µL浓度为10µM末端修饰一段Mg²⁺核酸酶1/2劈开碱基系列的PDGF-BB核酸适配体S1，所述核酸适配体S1的碱基序列为5’-CAG GCT ACG GCA CGT AGAGCA TCA CCA TGA TCC TGT TTT TTT TTT TTT TTT TTT TTT TTT TTT TTT TTT TTT AGAGTA AGC ACC CAT GTT AGA CCT C-3’；/n再向#2 PV管中加入10µL浓度为10µM末端修饰一段Mg²⁺核酸酶1/2劈开碱基系列的PDGF-BB核酸适配体S2，所述核酸适配体S2的碱基序列为5’-CCT GCT CAG CGA TCT TACTCT TTT TTT TTT TTT TTT TTT TTT TTT TTT TTT TTT TTT CAG GCT ACG GCA CGT AGAGCA TCA CCA TGA TCC TG-3’；/n向#3 PV管中加入10µL浓度为10µM的Mg²⁺核酸酶1/2劈开碱基系列组成的发夹结构DNA探针H1，所述探针H1中包含有G-四链体DNA酶功能结构，探针H1的碱基序列为5’- GC CCTACC CAA GCG ATT AAC GAG GTC (rA) AGC AGG GGG TAG GGC GG GTT GGG A -3’，其中H1中的rA表示该位置的腺苷核糖核酸，其余均为脱氧核糖核酸；/n向#4 PV管中加入10µL浓度为10µM的Mg²⁺核酸酶1/2劈开碱基系列组成的发夹结构DNA探针H2，所述探针H2中包含有G-四链体DNA酶功能结构，探针H2的碱基序列为5’- TTT GGGTAG GGC GGG TTG GGA GAG GTC (rA) AGC AGG T GTT ACA CCC ATG T CT ACC CAA A-3’，其中H2中的rA表示该位置的腺苷核糖核酸，其余均为脱氧核糖核酸；/n向#5 PV管中加入10µL浓度为10µM的连接DNA溶液，所述连接DNA溶液的碱基系列为5’-GAC CTC CCT GCT-3’；/n将#1、#2和#5 PV管中的溶液加热至95℃，保持5min后迅速降温至室温，分别得到单链DNA溶液S1、单链DNA溶液S2和连接DNA溶液待用；再将#3和#4 PV管中的溶液加热至95℃，保持5min后缓慢降温2h至室温，分别得到稳定的发夹茎环结构DNA溶液H1、DNA溶液H2待用；/n（2）均相反应测定标准溶液中血小板衍生生长因子BB的含量/n取6个PV管，向每个PV管中均加入经步骤（1）高温退火后的10μL单链DNA溶液S1、10μL单链DNA溶液S2、10μL连接DNA溶液、10μL DNA溶液H1和10μL DNA溶液H2，再向6个PV管中分别加入10µL含有PDGF-BB的浓度梯度为0、0.002ng/mL、0.02ng/mL、0.2ng/mL、2ng/mL和20ng/mL 20mM的pH=7.4 Tris-HCl缓冲溶液，该Tris-HCl缓冲溶液中还含有100mM NaCl、10mMMgCl₂和10mM KCl，于37℃涡旋混匀反应120min；再向每个PV管中加入含有10µL 20µM氯化血红素的25mM pH=7.4 HEPES缓冲溶液，该HEPES缓冲溶液中还含有100mM NaCl、10mMMgCl₂、10mM KCl、0.05% Triton X-10和1% DMSO，于37℃涡旋混匀反应50min；接着向每个PV管中加入20µL含有20mM ABTS、40mM H₂O₂的20mM pH=7.4 Tris-HCl缓冲溶液，该Tris-HCl缓冲溶液中还含有100mM NaCl、10mM MgCl₂和10mM KCl，显色反应5min之后，利用紫外-可见分光光度计测定溶液的吸光度值，以建立吸光度与PDGF-BB浓度之间的定量关系；/n（3）样品中血小板衍生生长因子BB含量的检测/n取处理后的样品溶液10µL，向其中加入经步骤（1）高温退火后的10μL单链DNA溶液S1、10μL单链DNA溶液S2、10μL连接DNA溶液、10μL DNA溶液H1和10μL DNA溶液H2，于37℃涡旋混匀反应120min；再向其中加入含有10µL 20µM氯化血红素的25mM pH=7.4 HEPES缓冲溶液，该HEPES缓冲溶液中还含有100mM NaCl、10mM MgCl₂、10mM KCl、0.05% Triton X-10和1%DMSO，于37℃涡旋混匀反应50min；接着向其中加入20µL含有20mM ABTS、40mM H₂O₂的20mMpH=7.4 Tris-HCl缓冲溶液，该Tris-HCl缓冲溶液中还含有100mM NaCl、10mM MgCl₂和10mMKCl，显色反应5min之后，利用紫外-可见分光光度计测定溶液的吸光度值，根据步骤（2）中得到的吸光度与PDGF-BB浓度之间的定量关系，计算出样品溶液中血小板衍生生长因子的含量。/n