[发明专利]一种检测血小板衍生生长因子BB的均相生物分析方法及其应用有效

专利信息
申请号: 201910916793.4 申请日: 2019-09-26
公开(公告)号: CN110468182B 公开(公告)日: 2023-02-03
发明(设计)人: 赖国松;谢一铭 申请(专利权)人: 湖北师范大学
主分类号: C12Q1/682 分类号: C12Q1/682
代理公司: 苏州市知腾专利代理事务所(普通合伙) 32632 代理人: 柏琳容
地址: 435000*** 国省代码: 湖北;42
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摘要: 一种检测血小板衍生生长因子BB的均相生物分析方法及其应用,利用两条核酸适配体S1和S2与PDGF‑BB之间的夹心识别反应,得到一种含有Mg2+核酸酶的功能核酸结构;再通过引入两个由G‑四链体DNA酶和另外一种Mg2+核酸酶的1/2劈开碱基序列组成的发夹结构DNA,以及连接DNA,利用Mg2+激活其核酸酶催化剪切作用来实现目标物循环及发夹结构中设计的G‑四链体DNA酶的双重放大释放;利用G‑四链体DNA酶的催化显色反应构建显色产物吸光度与PDGF‑BB分析物浓度之间的定量关系;本发明方法操作简单,成本低廉,灵敏度高,重复性好,对于临床诊断领域蛋白质标记物的方便、自动化检测具有十分重要的应用价值。
搜索关键词: 一种 检测 血小板 衍生 生长因子 bb 均相 生物 分析 方法 及其 应用
【主权项】:
1.一种检测血小板衍生生长因子BB的均相生物分析方法,其特征在于包括以下步骤:/n(1)DNA链的高温退火处理/n取5个PV管并分别编号为#1、#2、#3、#4和#5,向每个PV管中加入190µL浓度为20mM pH=7.4的三羟甲基氨基甲烷缓冲溶液,所述缓冲溶液中含有100mM NaCl、10mMKCl和10mMMgCl2;/n接着向#1PV管中加入10µL浓度为10µM末端修饰一段Mg2+核酸酶1/2劈开碱基系列的PDGF-BB核酸适配体S1,所述核酸适配体S1的碱基序列为5’-CAG GCT ACG GCA CGT AGAGCA TCA CCA TGA TCC TGT TTT TTT TTT TTT TTT TTT TTT TTT TTT TTT TTT TTT AGAGTA AGC ACC CAT GTT AGA CCT C-3’;/n再向#2 PV管中加入10µL浓度为10µM末端修饰一段Mg2+核酸酶1/2劈开碱基系列的PDGF-BB核酸适配体S2,所述核酸适配体S2的碱基序列为5’-CCT GCT CAG CGA TCT TACTCT TTT TTT TTT TTT TTT TTT TTT TTT TTT TTT TTT TTT CAG GCT ACG GCA CGT AGAGCA TCA CCA TGA TCC TG-3’;/n向#3 PV管中加入10µL浓度为10µM的Mg2+核酸酶1/2劈开碱基系列组成的发夹结构DNA探针H1,所述探针H1中包含有G-四链体DNA酶功能结构,探针H1的碱基序列为5’- GC CCTACC CAA GCG ATT AAC GAG GTC (rA) AGC AGG GGG TAG GGC GG GTT GGG A -3’,其中H1中的rA表示该位置的腺苷核糖核酸,其余均为脱氧核糖核酸;/n向#4 PV管中加入10µL浓度为10µM的Mg2+核酸酶1/2劈开碱基系列组成的发夹结构DNA探针H2,所述探针H2中包含有G-四链体DNA酶功能结构,探针H2的碱基序列为5’- TTT GGGTAG GGC GGG TTG GGA GAG GTC (rA) AGC AGG T GTT ACA CCC ATG T CT ACC CAA A-3’,其中H2中的rA表示该位置的腺苷核糖核酸,其余均为脱氧核糖核酸;/n向#5 PV管中加入10µL浓度为10µM的连接DNA溶液,所述连接DNA溶液的碱基系列为5’-GAC CTC CCT GCT-3’;/n将#1、#2和#5 PV管中的溶液加热至95℃,保持5min后迅速降温至室温,分别得到单链DNA溶液S1、单链DNA溶液S2和连接DNA溶液待用;再将#3和#4 PV管中的溶液加热至95℃,保持5min后缓慢降温2h至室温,分别得到稳定的发夹茎环结构DNA溶液H1、DNA溶液H2待用;/n(2)均相反应测定标准溶液中血小板衍生生长因子BB的含量/n取6个PV管,向每个PV管中均加入经步骤(1)高温退火后的10μL单链DNA溶液S1、10μL单链DNA溶液S2、10μL连接DNA溶液、10μL DNA溶液H1和10μL DNA溶液H2,再向6个PV管中分别加入10µL含有PDGF-BB的浓度梯度为0、0.002ng/mL、0.02ng/mL、0.2ng/mL、2ng/mL和20ng/mL 20mM的pH=7.4 Tris-HCl缓冲溶液,该Tris-HCl缓冲溶液中还含有100mM NaCl、10mMMgCl2和10mM KCl,于37℃涡旋混匀反应120min;再向每个PV管中加入含有10µL 20µM氯化血红素的25mM pH=7.4 HEPES缓冲溶液,该HEPES缓冲溶液中还含有100mM NaCl、10mMMgCl2、10mM KCl、0.05% Triton X-10和1% DMSO,于37℃涡旋混匀反应50min;接着向每个PV管中加入20µL含有20mM ABTS、40mM H2O2的20mM pH=7.4 Tris-HCl缓冲溶液,该Tris-HCl缓冲溶液中还含有100mM NaCl、10mM MgCl2和10mM KCl,显色反应5min之后,利用紫外-可见分光光度计测定溶液的吸光度值,以建立吸光度与PDGF-BB浓度之间的定量关系;/n(3)样品中血小板衍生生长因子BB含量的检测/n取处理后的样品溶液10µL,向其中加入经步骤(1)高温退火后的10μL单链DNA溶液S1、10μL单链DNA溶液S2、10μL连接DNA溶液、10μL DNA溶液H1和10μL DNA溶液H2,于37℃涡旋混匀反应120min;再向其中加入含有10µL 20µM氯化血红素的25mM pH=7.4 HEPES缓冲溶液,该HEPES缓冲溶液中还含有100mM NaCl、10mM MgCl2、10mM KCl、0.05% Triton X-10和1%DMSO,于37℃涡旋混匀反应50min;接着向其中加入20µL含有20mM ABTS、40mM H2O2的20mMpH=7.4 Tris-HCl缓冲溶液,该Tris-HCl缓冲溶液中还含有100mM NaCl、10mM MgCl2和10mMKCl,显色反应5min之后,利用紫外-可见分光光度计测定溶液的吸光度值,根据步骤(2)中得到的吸光度与PDGF-BB浓度之间的定量关系,计算出样品溶液中血小板衍生生长因子的含量。/n
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