[发明专利]PD-1基因缺陷型PD-1-CART细胞制剂的制法在审
| 申请号： | 201910938616.6 | 申请日： | 2019-09-30 |
| 公开（公告）号： | CN110592140A | 公开（公告）日： | 2019-12-20 |
| 发明（设计）人： | 王清路 | 申请（专利权）人： | 王清路;许晓松 |
| 主分类号： | C12N15/867 | 分类号： | C12N15/867;C12N15/90;C12N9/22;C12N15/66 |
| 代理公司： | 37280 淄博启智达知识产权代理事务所(特殊普通合伙) | 代理人： | 任永哲 |
| 地址： | 255086 山东省淄*** | 国省代码： | 山东;37 |
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| 摘要： | 本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及一种PD‑1基因缺陷型PD‑1‑CART细胞制剂的制法。PD‑1‑CAR嵌合序列构建，PD‑1‑CAR慢病毒构建，PD‑1基因缺陷型PD‑1‑CART细胞的构建。本发明首先通过突变PD‑1蛋白的ITSM基序而后获得具有PD‑L1靶向识别功能的T细胞胞外蛋白部分及跨膜信号引导区，而后通过构建慢病毒质粒获得带有新型CAR结构的慢病毒，转染PD‑1基因缺陷型的T淋巴细胞，即得。本发明提升了T淋巴细胞靶向杀灭肿瘤细胞的能力且降低了副作用，并能增强长期肿瘤免疫，并为类似新型CAR基因结构的开发提供了参考。 | ||
| 搜索关键词： | 构建 基因缺陷型 慢病毒 分子生物学技术 慢病毒质粒 靶向识别 胞外蛋白 嵌合序列 细胞制剂 信号引导 肿瘤免疫 肿瘤细胞 靶向 基序 制法 转染 突变 蛋白 细胞 参考 开发 | ||
【主权项】：
1.一种PD-1基因缺陷型PD-1-CART细胞制剂的制法，其特征在于包括以下步骤：/n(1)PD-1-CAR嵌合序列构建/n人工合成PD-1-CAR嵌合序列，并在全序列5’端ATG前添加EcoRI位点，3’端TGA终止密码子后添加Spel位点，然后克隆进pMD18-T载体，得到pMD18-T-CAR载体；/nPD-1-CAR嵌合序列为SEQ ID NO.1；/n(2)PD-1-CAR慢病毒构建/n基于pMD18-T-CAR载体构建pSin-EF2-Pur-CAR载体，然后将pSin-EF2-Pur-CAR、psPAX2和pMD2.G质粒混匀后转染293T细胞，制备PD-1-CAR慢病毒；/n(3)PD-1基因缺陷型PD-1-CART细胞的构建/n将PD-1-CAR慢病毒转染PD-1基因缺陷型T淋巴细胞，转染结束后收集的细胞采用流式细胞仪进行分离，分离所得单克隆细胞扩大培养，提取基因组进行测序分析、鉴定，继续扩大培养，即得PD-1基因缺陷型PD-1-CART细胞制剂。/n
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