[发明专利]一种艾曲波帕介导巨噬细胞抗血管生成作用验证方法在审
| 申请号： | 201910965148.1 | 申请日： | 2019-10-11 |
| 公开（公告）号： | CN110656152A | 公开（公告）日： | 2020-01-07 |
| 发明（设计）人： | 杨喜燕;张建革;杨柳青;栾朋伟;崔乾飞;周静 | 申请（专利权）人： | 郑州大学 |
| 主分类号： | C12Q1/02 | 分类号： | C12Q1/02 |
| 代理公司： | 11638 北京权智天下知识产权代理事务所(普通合伙) | 代理人： | 王新爱 |
| 地址： | 450000 河南省郑*** | 国省代码： | 河南;41 |
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| 摘要： | 本发明提供一种艾曲波帕(Eltrombopag，ELB)介导巨噬细胞抗血管生成作用验证方法，通过MTT实验、q‑PCR和ELISA检测ELB对巨噬细胞增殖、血管生成相关因子(VEGF‑A、bFGF、MMP‑9)mRNA的表达及VEGF蛋白的影响；再通过MTT实验、细胞划痕实验、Matrigel基质胶成管实验，观察ELB通过巨噬细胞对内皮细胞增殖、迁移和管腔形成的影响。本发明证实了ELB能抑制巨噬细胞的增殖，抑制血管生成相关因子mRNA的表达及VEGF蛋白的释放，同时发现ELB作用于巨噬细胞的上清能显著抑制内皮细胞的增殖、迁移和小管形成，说明ELB可以介导巨噬细胞而具有抗血管生成作用。 | ||
| 搜索关键词： | 巨噬细胞 增殖 抗血管生成作用 介导 迁移 抑制巨噬细胞 抑制内皮细胞 抑制血管生成 艾曲波帕 管腔形成 划痕实验 细胞增殖 血管生成 小管 验证 细胞 释放 观察 发现 | ||
【主权项】：
1.一种艾曲波帕(Eltrombopag，ELB)介导巨噬细胞抗血管生成作用验证方法，其特征在于，包括以下步骤：/n配制至少包括细胞培养液、细胞冻存液、ELB母液和MTT溶液在内的试剂；对巨噬细胞Raw264.7进行细胞培养，所述细胞培养包括细胞复苏、细胞传代、细胞冻存和细胞计数；/n用MTT法检测不同浓度的ELB母液对所述巨噬细胞Raw264.7细胞增殖的影响，包括：/n取对数生长期的巨噬细胞Raw264.7，弃去旧的培养基，3mL PBS洗一遍，弃上清；每皿加入3mL PBS反复吹打巨噬细胞Raw264.7，使其脱落成单细胞悬液，将细胞悬液移入15mL离心管中；1000rpm离心5min；弃上清，加入适量完全培养液，混匀，取少量细胞悬液进行稀释，吸60μL稀释后的液体加入细胞计数板中进行细胞计数；调整细胞悬液密度，以每孔6000个细胞接种于96孔板中，每孔100μL，96孔板最外圈加一圈PBS；/n将铺好细胞的96孔板放入37℃、5％CO2的细胞培养箱中培养过夜至贴壁；弃上清，每孔加入200μL含不同浓度药物的细胞培养液，各组浓度均设置6个复孔；/n放入37℃、5％CO2的细胞培养箱中孵育48h；48h后每孔加入20μL MTT溶液，继续孵育4h；弃去上清，每孔加入150μL DMSO，放于摇床上摇10min，使蓝紫色结晶完全溶解；用酶标仪在570nm波长处测吸光度值；/n按以下公式计算细胞存活率，绘制不同浓度下的生存曲线，计算ELB作用于巨噬细胞Raw264.748 h后的IC
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