[发明专利]基于CRISPR-Cas13d系统的sgRNA高效作用靶点的筛选方法及应用

摘要

本发明提供一种基于CRISPR‑Cas13d系统的sgRNA高效作用靶点的筛选方法及应用，特别是在RNA病毒敲降方面的应用。本发明利用mCherry荧光报告基因，将PRRSV病毒ORF4和ORF5两个表达阅读框序列分别融合到mCherry基因的碳端构建筛选CRISPR‑Cas13d系统的sgRNA高效作用靶点的荧光报告系统，利用CRISPR‑Cas13d高效切割mRNA的特性，进行高效率sgRNAs的快速筛选。然后利用筛选出的高效靶向结合的sgRNAs进行CRISPR‑Cas13d系统高效降解PRRSV‑GFP重组病毒。本发明提供的RNA病毒敲降方法具有高效率，高精准率及低脱靶率的优势。

主权项

1.基于CRISPR-Cas13d系统的sgRNA高效作用靶点的筛选方法，其特征在于，包括以下步骤：/n1)合成目标核酸序列，将目标核酸序列构建到含有报告基团的载体中，且目标核酸序列与报告基团位于同一表达盒内，得到报告载体；/n2)根据目标核酸序列，设计并合成一系列基于CRISPR-Cas13d系统的sgRNA序列，并将这些sgRNA序列分别构建到基于CRISPR-Cas13d系统的sgRNA表达载体中；/n3)将步骤1)的报告载体、含有Cas13d蛋白的表达载体与步骤2)所得重组载体共同导入真核细胞中，得到一系列转化细胞；待转化细胞培养一段时间后，分别鉴定不同sgRNA对目标核酸序列的切割效率，根据切割效率筛选出高效sgRNA；/n其中，步骤1)所述目标核酸序列含有或编码5‘端具有帽子结构，且3’端具有多聚腺嘌呤核苷酸尾结构的核苷酸序列。/n