[发明专利]一种从浓香型大曲中分离纯化酯化酶的方法在审
| 申请号： | 201911017251.X | 申请日： | 2019-10-24 |
| 公开（公告）号： | CN110628744A | 公开（公告）日： | 2019-12-31 |
| 发明（设计）人： | 曹新志;任林生;肖梦月;钟利明 | 申请（专利权）人： | 宜宾五粮液股份有限公司;四川轻化工大学 |
| 主分类号： | C12N9/20 | 分类号： | C12N9/20;C12N9/16;C12N9/14 |
| 代理公司： | 51229 成都正华专利代理事务所(普通合伙) | 代理人： | 李蕊;郭艳艳 |
| 地址： | 644007 四川*** | 国省代码： | 四川;51 |
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| 摘要： | 本发明公开了一种从浓香型大曲中分离纯化酯化酶的方法，以浓香型大曲为试验材料，用DEAE纤维素DE‑52离子交换层析和葡聚糖G‑100凝胶层析相结合的方法对大曲中的酯化酶进行了分离纯化。本发明产物通过SDS‑PAGE检验其纯度时显示为两条主要的条带，分子量分别为37.2kD和30.8kD，经过四步纯化后，酯化酶被纯化了3.49倍，酶活回收率为28.01％。 | ||
| 搜索关键词： | 酯化酶 浓香型大曲 分离纯化 大曲 离子交换层析 发明产物 凝胶层析 试验材料 葡聚糖 酶活 条带 回收率 检验 | ||
【主权项】：
1.一种从浓香型大曲中分离纯化酯化酶的方法，其特征在于，包括以下步骤：/nS1.将浓香型大曲粉碎，然后过40目筛，得到大曲粉；/nS2.将步骤S1所得大曲粉置于浓度为0.2-0.4mol/L、pH6的NaCl溶液中，于3-5℃温度下浸泡1-2h，过滤得到滤液；/nS3.将步骤S2所得滤液在3-5℃搅拌，加入硫酸铵，使溶液饱和度达到25-35％，搅拌15-30min，置于3-5℃温度下沉淀1.5-2.5h后，冷冻离心13-15min，取上清液，再加入硫酸铵使溶液饱和度达到75-85％，搅拌待硫酸铵全部溶解后再搅拌15min，搅拌15-30min，置于3-5℃温度下沉淀1.5-2.5h后，冷冻离心16-25min，取沉淀加入pH＝8.5的Tris-HCl缓冲液复溶，再于3-5℃下离心去除沉淀，得到粗酶液A；/nS4.将步骤S3所得粗酶液A在3-5℃搅拌，加入体积为粗酶液A 3-4倍的-20℃预冷的丙酮，于-20℃放置过夜，然后冷冻离心13-15min，弃上清液，对沉淀清洗除杂后，用pH＝8.5的Tris-HCl缓冲液复溶，再于3-5℃下离心去除沉淀，得到粗酶液B；/nS5.用0.02mol/L、pH＝8.5Tris-HCl缓冲液平衡DEAE纤维素DE-52离子交换层析柱，将步骤S4所得粗酶液B经0.45μm微孔滤膜过滤后进行梯度洗脱，得浓缩液；/nS6.将葡聚糖G-100凝胶加水煮沸2h，静置沉降后，弃去上层液，作为填料装柱，通过2-3倍柱床体积的0.02mol/L、pH＝8.5Tris-HCl缓冲液作为洗脱液使柱床稳定，将步骤S5所得浓缩液经0.45μm微孔滤膜过滤后进行洗脱，即得。/n
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