[发明专利]黔北麻羊TIMP1基因真核表达载体的构建方法

摘要

本发明公开了一种黔北麻羊TIMP1基因真核表达载体的构建方法。本发明能在构建黔北麻羊TIMP1基因真核表达载体时，免除繁琐步骤，简化操作，节省科研成本。本发明通过简单的方法克隆黔北麻羊TIMP1基因并构建真核表达载体，为黔北麻羊基因检测提供基础方法，便于从基因水平研究其对黔北麻羊繁殖相关性状的影响，为黔北麻羊产羔性状的分子机制提供理论依据。

主权项

1.一种黔北麻羊TIMP1基因真核表达载体的构建方法，其特征在于，包含如下步骤进行：/n1)提取黔北麻羊卵巢组织的RNA，经逆转录获得黔北麻羊卵巢组织的cDNA，将cDNA经PCR扩增获得TIMP1基因的CDS区序列，将扩增后产物胶回收与pMD19-T载体连接，转化进入TOP10感受态细胞进行培养，蓝白斑筛选，选取白色菌落经LB液体培养基扩培，PCR检测验证，质粒提取测序验证；回收重组质粒和pEGFP-N3载体的双酶切的目的片段进行连接，获得pEGFP-N3(+)-TIMP1重组载体；/n2)用1.5％的琼脂糖凝胶对PCR产物进行电泳检测，切胶回收目的条带和pMD19-T载体连接；连接体系：pMD19-T载体1ul，目的片段5ul，buffer 1ul，T4DNA连接酶1ul，ddH2O 1ul；将反应混合物在16℃金属浴连接过夜；将反应产物连接到100ul感受态细胞中，培养后选取白色单菌落分别加入盛有AMP抗性的LB液体培养基中，37℃摇床振荡培养12h～16h PCR检测菌液阳性克隆，提取重组质粒测序验证；/n3)双酶切体系如下：重组质粒、pEGFP-N3(+)空载体各8ul，EcoR Ⅰ 2ul，BamH Ⅰ 2ul，10×QuickCut Green Buffer 2ul，ddH