[发明专利]利用CRISPR/Cas9敲除文库技术筛选JEV抗性基因的方法与靶点

摘要

本发明提供了利用CRISPR/Cas9敲除文库技术筛选JEV抗性基因的方法与靶点。具体地，本发明提供了一种基于全基因组CRISPR/Cas9敲除文库策略，筛选JEV抗性相关基因的方法及候选靶基因。本发明方法先利用一个包含有针对猪全基因组的sgRNA质粒库包装慢病毒，感染Cas9稳定表达的猪体细胞，通过流式细胞术富集获得全基因组基因敲除细胞库。再利用JEV感染敲除细胞库，收集存活细胞，提取基因组DNA并进行PCR扩增，建库和高通量测序，最后利用生物信息学分析获得数十个JEV抗性候选功能基因。本发明建立了基于全基因CRISPR/Cas9敲除文库策略筛选猪的JEV抗病基因的方法，所鉴定的候选基因靶点可用于抑制JEV复制的靶向药物开发与抗病育种研究。

主权项

1.一种确定潜在的JEV抗性相关基因的方法，其特征在于，包括步骤：/n(a)提供稳定表达Cas9并经重组病毒感染并存活的猪体细胞作为第一细胞库，以及不表达Cas9的猪体细胞作为对照细胞，其中所述第一细胞库的细胞和对照细胞属于同一类型的体细胞；/n其中，所述的重组病毒是可感染所述猪体细胞的病毒，并且分别用于表达靶向猪基因的不同的敲除sgRNA所构成的sgRNA集(sgRNA)，其中sgRNA集包括N种靶向不同的猪基因的重组病毒，其中N为≥1000的正整数；/n(b)在对照组中，用日本脑炎病毒(JEV)感染所述的对照细胞；和在测试组中，用日本脑炎病毒(JEV)感染所述的第一细胞库的猪体细胞即测试细胞，其中对照组和测试组的实验条件是相同或本质上相同的；/n(c)观察所述对照组中对照细胞的存活情况，并在对照组的细胞死亡率D1达到预定值(如D1≥90％，最佳地为100％)时，收集在测试组中存活的猪体细胞；/n(d)将所述的存活细胞用作下一轮测试过程中测试组的测试细胞，重复步骤(b)和(c)，进行下一轮的测试，从而获得第R轮的存活细胞，其中，R为2-10的正整数；/n(e)对于第j轮的存活细胞，其中2≤j≤R，确定在所述存活细胞中富集的敲除sgRNA的种类；和/n(f)基于所述确定的经富集的敲除sgRNA的种类，从而相对应的靶基因，即为潜在的JEV抗性相关基因。/n