[发明专利]一种花生转基因的方法在审
| 申请号： | 201911094331.5 | 申请日： | 2019-11-11 |
| 公开（公告）号： | CN110699377A | 公开（公告）日： | 2020-01-17 |
| 发明（设计）人： | 史刚荣;陈楠楠;王曦;陈思远;朱兔篮;曹琪琪 | 申请（专利权）人： | 淮北师范大学 |
| 主分类号： | C12N15/84 | 分类号： | C12N15/84;C12N15/65;A01H1/00 |
| 代理公司： | 51241 成都方圆聿联专利代理事务所(普通合伙) | 代理人： | 李鹏 |
| 地址： | 235000 *** | 国省代码： | 安徽;34 |
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| 摘要： | 本发明公开了一种花生转基因的方法，包括如下步骤：(1)消毒浸种，(2)切取半粒种子，(3)预培养，(4)农杆菌浸染，(5)共培养，(6)蛭石培养，(7)潮霉素筛选，(8)PCR检测。本发明直接将共培养花生种子播种在蛭石中成苗，并利用潮霉素水培法筛选阳性植株，避免了组织培养过程中复杂而繁琐的无菌操作培养以及成苗后的练苗过程。无需特殊的器材、技术和培养条件，操作过程极其简单。本发明直接对花生半粒种子进行遗传转化，大大缩短了遗传转化的时间，从浸种到成苗仅需20天。 | ||
| 搜索关键词： | 成苗 遗传转化 潮霉素 浸种 筛选 组织培养过程 花生转基因 农杆菌浸染 操作过程 花生种子 培养条件 无菌操作 阳性植株 蛭石培养 水培法 预培养 切取 蛭石 花生 播种 消毒 器材 | ||
【主权项】：
1.一种花生转基因的方法，其特征在于，包括如下步骤：/n(1)消毒浸种：将花生种子先用70％酒精清洗1～2min，再用0.1％升汞清洗5～8min，然后用无菌水清洗3次每次3～5min，最后将花生移至无菌水中浸种24h。/n(2)切取半粒种子：在无菌条件下，将经过消毒浸种处理后的花生剥皮，然后将刀插入花生的裂缝中，压住一片子叶，再用工具夹住另一片子叶将其去除；/n(3)预培养：将半粒种子放于MS液体基本培养基中，将其放于25℃、100rpm的摇床中暗培养1～3d；/n(4)农杆菌浸染：利用含有潮霉素抗性基因作为选择标记基因的pCXSN质粒载体构建AhZIP1基因的过表达载体，并转入农杆菌GV3101中；活化的农杆菌接种于含有20μL卡那霉素，100μL利福平的20mLYEP液体培养基中，于240rpm、28℃摇床震荡3～4h；摇菌至OD600为0.6～0.9时离心收菌，将重悬好的菌种置于收菌MS中，并加入浓度为150μM的乙酰丁香酮和1mM的二硫苏糖醇；将步骤(3)处理后的半粒种子移入菌液中，30Hz超声处理4～10min，然后在真空度为0.06MP的条件下真空处理5～10min；/n(5)共培养：将已侵染农杆菌的半粒种子置于含有150μM AS的液体MS培养基中，将其放于25℃、100rpm的摇床中暗培养2～5d；/n(6)蛭石培养：完成共培养的半粒种子洗涤后直接播种于蛭石中，在光照条件下进行培养；/n(7)潮霉素筛选：待花生长出两个复叶后，移苗至含30～40％潮霉素的Hoagland营养液中进行筛选；培养3天后，存活的正常植株即为潮霉素抗性植株；/n(8)PCR检测：潮霉素筛选获得的潜在转基因阳性植株可进一步移到蛭石中进行培养，待苗长大后，剪取叶片提取DNA，进行PCR检测鉴定。/n
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