[发明专利]赤眼鳟LGP2基因多克隆抗体的制备方法

摘要

本发明公开了一种赤眼鳟LGP2基因多克隆抗体的制备方法，包括(1)赤眼鳟LGP2基因的克隆、(2)赤眼鳟LGP2基因重组表达载体的构建、(3)赤眼鳟LGP2蛋白表达及破菌流程、(4)重组蛋白的纯化及浓度测定和(5)多克隆抗体的制备。本发明成功制备赤眼鳟实验遗传和生理基因2多克隆抗体，可用于检测赤眼鳟组织的LGP2蛋白水平，为鱼类抗病育种研究提供蛋白水平检测工具。

主权项

1.赤眼鳟LGP2基因多克隆抗体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：/n(1)赤眼鳟LGP2基因的克隆/n提取赤眼鳟肾脏组织总RNA，反转录合成5’和3’cDNA第一链；设计两对特异性引物：LGP2-5’(W)和LGP2-3’(W)，LGP2-5’(N)和LGP2-3’(N)，核苷酸序列分别如SEQ ID No.1、SEQID No.2、SEQ ID No.3、和SEQ ID No.4所示；LGP2-5’(W)和LGP2-3’(W)分别用于第一轮的5’和3’RACE-PCR扩增；所得PCR产物作为第二轮PCR的模板；利用LGP2-5’(N)和LGP2-3’(N)进行第二轮5’和3’RACE-PCR扩增；对PCR产物进行纯化、连接T载体，转化并测序确认；拼接产物序列获得赤眼鳟LGP2基因全长cDNA序列；/n(2)赤眼鳟LGP2基因重组表达载体的构建/n设计特异性引物LGP2-OF和LGP2-OR，核苷酸序列分别如SEQ ID No.5和SEQ ID No.6所示；以步骤(1)得到的cDNA为模板进行PCR扩增；将PCR产物和pET-28a(+)表达载体进行KpnI和BamHI的双酶切，纯化回收，经T4连接酶连接后转化大肠杆菌DH5α，获得重组表达载体pET-28a-SUMO-LGP2并测序验证；/n(3)赤眼鳟LGP2蛋白表达及破菌流程/n将步骤(3)得到的重组表达载体pET-28a-SUMO-LGP2转化大肠杆菌BL21(DE3)，在含有卡那霉素的LB培养液中培养至OD值为0.6，加入IPTG进行诱导；离心收集菌体；破菌，利用SDS-PAGE电泳确定蛋白表达及纯度；/n(4)重组蛋白的纯化及浓度测定/n利用纯化试剂盒对步骤(3)得到的重组蛋白上样、洗脱、样品处理及再生处理方法进行纯化；采用Lowry法测蛋白浓度，设置不同浓度的标准蛋白质溶液，绘制标准曲线，根据样品的光吸收值与标准曲线计算样品蛋白浓度；/n(5)多克隆抗体的制备/n将步骤(4)纯化的赤眼鳟pET-28a-SUMO-LGP2表达蛋白作为抗原，对新西兰大白兔进行免疫，收集兔抗血清，纯化得到赤眼鳟LGP2多克隆抗体。/n