[发明专利]一种PDGFB启动子活性报告质粒的构建方法在审
| 申请号： | 201911187386.0 | 申请日： | 2019-11-28 |
| 公开（公告）号： | CN110777146A | 公开（公告）日： | 2020-02-11 |
| 发明（设计）人： | 翟旭光 | 申请（专利权）人： | 南通大学 |
| 主分类号： | C12N15/113 | 分类号： | C12N15/113;C12N15/70;C12N15/66 |
| 代理公司： | 32249 南京瑞弘专利商标事务所(普通合伙) | 代理人： | 孟捷 |
| 地址： | 226019 *** | 国省代码： | 江苏;32 |
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| 摘要： | 本发明公开了一种PDGFB基因启动子活性报告质粒的构建方法，提取正常小鼠外周血液，利用DNA抽提试剂盒提取小鼠基因组DNA，检测DNA纯度以及完整性后备用；数据库检索，得到小鼠PDGFB基因的启动子序列；PCR扩增PDGFB基因启动子序列，引物两端加入相应限制性内切酶序列及保护碱基；扩增产物经DNA凝胶回收试剂盒回收纯化；回收纯化的PCR产物和荧光素酶报告质粒载体pGL3‑Basic‑vector，分别用Kpn I、Hind III双酶切；酶切产物经凝胶回收试剂盒回收纯化；回收目的基因片段和载体片段，用T4连接酶16℃连接过夜；次日将连接产物转化感受态大肠杆菌，涂布固体LB培养基平板过夜。 | ||
| 搜索关键词： | 回收 感受态大肠杆菌 基因启动子活性 基因启动子序列 小鼠基因组DNA 限制性内切酶 荧光素酶报告 正常小鼠外周 启动子序列 数据库检索 扩增产物 连接产物 酶切产物 目的基因 载体片段 质粒载体 试剂盒 双酶切 构建 碱基 凝胶 小鼠 引物 质粒 备用 血液 基因 检测 转化 | ||
【主权项】：
1.一种PDGFB基因启动子活性报告质粒的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：/nS1、提取正常小鼠外周血液，利用血液DNA 抽提试剂盒提取小鼠基因组DNA，检测DNA纯度以及完整性后备用；/nS2、数据库检索，小鼠PDGFB基因的转录起始位点TSS区域长600bp，即-499-100bp的启动子序列；/nS3、PCR扩增PDGFB基因启动子序列，引物两端加入相应限制性内切酶序列及保护碱基；KpnI的序列如SEQ ID:NO:3所示；HindⅢ的序列如SEQ ID:NO:4所示；/nS4、扩增产物经DNA凝胶回收试剂盒回收纯化；/nS5、回收纯化的PCR产物和荧光素酶报告质粒载体pGL3-Basic-vector，分别用Kpn I、Hind III双酶切；/nS6、酶切产物经凝胶回收试剂盒回收纯化；/nS7、回收目的基因片段和载体片段，用T4连接酶16℃连接过夜；/nS8、次日将连接产物转化感受态大肠杆菌，涂布固体LB培养基平板过夜；/nS9、挑单克隆菌落于LB液体培养基扩大培养；/nS10、质粒小量提取试剂盒提取质粒。/n
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