[发明专利]一种宿主米曲霉敲除系统及其构建方法与应用有效
| 申请号： | 201911214673.6 | 申请日： | 2019-12-02 |
| 公开（公告）号： | CN110747221B | 公开（公告）日： | 2021-08-20 |
| 发明（设计）人： | 王婧臻;郑红云;楚杰;王莹 | 申请（专利权）人： | 齐鲁工业大学;山东省科学院生物研究所 |
| 主分类号： | C12N15/80 | 分类号： | C12N15/80;C12N1/15;C12R1/69 |
| 代理公司： | 济南竹森知识产权代理事务所(普通合伙) 37270 | 代理人： | 朱家富 |
| 地址： | 250353 山东*** | 国省代码： | 山东;37 |
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| 摘要： | 本发明涉及一种宿主米曲霉表达系统及其构建方法与应用。所述宿主米曲霉表达系统的构建方法，步骤如下：(i)将重组质粒pBluescript‑hph‑rfp的多克隆位点上通过酶切连接的方法构建上敲除同源臂；(ii)将活化后的曲霉菌丝加入到细胞壁裂解酶溶液中，制得感受态原生质体；然后加入含有敲除同源臂的重组质粒，制得转化原生质体；(iii)将转化原生质体进行筛选培养，选取转化子，制得宿主米曲霉表达系统。本发明首次将RFP红色荧光蛋白应用到米曲霉基因敲除的过程当中，可以快速有效的排除掉大量假阳性的转化子。 | ||
| 搜索关键词： | 一种 宿主 曲霉 系统 及其 构建 方法 应用 | ||
【主权项】：
1.一种重组质粒pBluescript-hph-rfp，其特征在于，采用如下方法制备：/n(1)以pCSR1::hph质粒为模板，进行PCR扩增，获得潮霉素抗性基因片段；/n所述PCR扩增的特异引物，核苷酸序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所述：/n(2)以pDB790，进行PCR扩增，获得红色荧光蛋白表达基因片段；/n所述PCR扩增的特异引物，核苷酸序列如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所述：/n(3)以步骤(1)制得的潮霉素抗性基因片段和步骤(2)制得的红色荧光蛋表达基因片段为模板，采用核苷酸序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.4所述的引物经overlap PCR扩增，制得HPH+RFP表达元件；/n(4)将载体pBluescript和步骤(3)制得的HPH+RFP表达元件经限制性内切酶EcoRΙ和BamHΙ双酶切，然后进行连接，制得重组质粒pBluescript-hph-rfp。/n
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