[发明专利]噬菌蛭弧菌生态制剂的制备方法

摘要

本发明涉及一种具有广谱制菌作用的生态制剂，特别涉及噬菌蛭弧菌生态活性制剂。本发明采用从自然水体、土壤，及人类、动物的粪便等分离出来的噬菌蛭弧菌，进行纯化、培养，制备成菌母液，再将其裂解谱中的一种宿生菌进行纯化、培养，制备成浓缩菌液，按一定比例将二者混合，通过固体或液体培养法，制成生态活性制剂。本发明的生态制剂避免了化学消毒剂对生态环境平衡的破坏，也避免了抗生素在防治人、动物细菌性疾病方面的诸多弊病。

主权项

1、噬菌蛭弧菌生态制剂的制备方法.取大肠杆菌C600，或取噬菌蛭弧菌敏感裂解菌谱中的其它标准菌株作为宿主菌菌种，再取噬菌蛭弧菌—81，其特征在于；(1—1—1)取新鲜牛肉(却除脂肪、肌膜、肌腱)切成小块并绞碎，放入器皿中，加蒸馏水1000ml，混合并置于冰箱中至少36小时，再将牛肉浸液取出煮沸20分钟，加压过滤，继续煮沸至原量2/3，再加入蛋白胨10克、氯化钠5克，并以蒸馏水补足其蒸发掉的水分，加热并加入15％氢氧化钠溶液5ml，继续煮沸，矫正PH值7.4至7.6，过滤后放入器皿中，置高压灭菌器内经15磅20分钟灭菌，这是肉浸液培养基；(1—1—2)取蛋白胨20克、牛肉膏5克、氯化钠5克、琼脂20克、蒸馏水1000ml放入器皿中混合，加热溶解，加15％氢氧化钠2ml，矫正PH值7.4至7.6，煮沸，并置于高压灭菌器内经15磅15分钟灭菌，置于45C恒温水浴箱中30分钟，分装于灭菌9cm平皿中，这是营养琼脂；(1—1—3)取琼脂18克，牛内膏5克、蒸馏水1000ml放入器皿中混合，加热溶解并过滤，再将蛋白胨5克、乳糖10克、胆盐10克、枸橼酸钠10克、硫代硫酸钠10克、枸橼酸铁0.5克混合后加入到已过滤的琼脂内，摇匀溶解稍加热，矫正PH值至7.1，然后加入0.5％中性红水溶液及0.1％煌绿溶液摇匀，煮沸并置45C恒温水浴箱30分钟后，分装于灭菌9cm平皿中，这是s·s琼脂；(1—1—4)取大肠杆菌C600划线接种于(1—1—1)步骤经干燥2小时的营养琼脂平皿上，置于37C培养箱中培养24小时，挑取单个光滑菌落，划线接种于(1—1—3)步骤经干燥2小时的S·S琼脂平皿中，置于37C培养箱中培养24小时，再挑取典型单个菌落，接种于(1—1—1)步骤的500ml肉浸液培养基中，置37C培养箱中培养6至8小时，培养基呈微混浊状；在克氏瓶中加入150ml(1—1—2)步骤的营养琼脂，封口后置于高压消毒锅中15磅15分钟灭菌后，平置于桌面待琼脂凝固，放入暖房中干燥2—3小时，再将干燥好的克氏瓶取出，去除封口，加入上述培养箱中培养6至8小时的20ml微混浊状的肉浸液，充分混匀后，吸出多余液体后封口，放入37C暖房中培养24小时，再将直径0.5cm玻璃珠分装于试管中，每支试管放入100粒，加盖置于高压消毒锅中15磅15分钟灭菌，然后将培养24小时的克氏瓶取出，加入生理盐水20ml，并将试管中的玻璃珠倒入克氏瓶中，左右轻摇克氏瓶，使瓶中琼脂表面长满灰白色的菌膜充分洗涤下来，再用10ml吸管吸出洗涤下来的菌液，装入消毒灭菌好的离心钢瓶中，用天平配平后，放入离心机中以3000转/分的速度旋转30分钟，取出弃去上清液，加入适量生理盐水，用10ml吸管充分吸洗后再离心、并去上清液、洗涤，反复三次，将三次离心洗涤好的浓缩菌液缓缓加入适量生理盐水摇匀，用细菌浊度标准管比浊，使浊度达10个/ml，装入灭菌瓶中，再将瓶放入不锈钢锅中隔水煮沸15分钟灭活，得到宿主菌浓缩菌液。(1—2—1)取琼脂粉20克加入到1000ml灭菌标准自来水容器中，再加入15％氢氧化钠2ml，矫正PH值至7.5±2，然后置于高压消毒锅中15磅15分钟，取出后放入45C恒温水浴箱中30分钟，分装于灭菌9cm平皿中，每块平皿约5ml，得到平皿底层培养基；(1—2—2)取琼脂粉5克加入到1000ml灭菌标准自来水容器中，再加入15％氢氧化钠2ml，矫正PH值至7.5±2，然后置于高压消毒锅中15磅15分钟，再放入45C恒温水浴箱中30分钟后，分装于灭菌试管中，每支试管2ml，得到平皿上层培养基。(1—2—3)取(1—2—2)步骤得到的平四上层培养基放入烧杯中隔水煮沸至试管中琼脂完全溶解，置于45C恒温水浴箱中20分钟，用1ml吸管吸取(1—1—4)步骤的宿主菌浓缩菌液(充分摇匀)0.1ml，加入到置于45C恒温水浴箱中的平皿上层培养基试管中，充分摇匀，再用1ml吸管吸取噬菌蛭弧菌—81菌液0.3ml，加入到同一试管中混合摇匀，迅速将试管中的混合菌液琼脂倒入经干燥2小时的平皿底层培养基中，摇匀并平置，待平皿中琼脂凝固后，将平皿反转平置于28C恒温培养箱中培养24至72小时，待噬斑形成并逐渐扩大相互融合后，每块9cm平皿倒入灭菌标准自来水5ml，洗下上层琼脂，浸泡15分钟，用10ml吸管吸出洗下的菌液，置于灭菌三角烧瓶中，得到噬菌蛭弧菌母液。(1—3—1)固体培养法：将(1—2—1)步骤的平皿底层培养基煮沸溶解，置于45C恒温水浴箱中20分钟后取出，倒入15cm灭菌平皿中，每块15—20ml，待琼脂凝固后反转干燥2小时，再将(1—2—2)步骤的平皿上层培养基煮沸溶解，置于45C恒温水浴箱中20分钟后取出，分装于灭菌试管中，每支试管10ml，并将试管置于45C恒温水浴箱中；用10ml吸管吸取1ml宿主菌浓缩菌液(充分摇匀)加入到上述置于45C恒温水浴箱中的试管中，再用10ml吸管吸取噬菌蛭弧菌母液3ml，加入到上述同一试管中，充分混合摇匀，并迅速将试管中的混合菌液琼脂倒入经干燥2小时的平皿底层上，摇匀并平置，待琼脂完全凝固后，将平皿反转平置于28C培养暖房中24至72小时，待噬斑形成并逐渐扩大、相互融合后取出，在每块平皿上倒入15至20ml灭菌标准自来水，洗下上层琼脂并浸泡15分钟，再用吸管将平皿中的菌液吸入1000ml放水瓶中，当效价达105—108/ml时，得到噬菌蛭弧菌生态制剂。(1—3—2)液体培养法：在10000ml放水瓶中加入灭菌标准自来水5000ml，再加入(1—1—4)步骤的宿主菌浓缩菌液5ml，同时加入(1—2—3)步骤噬菌蛭弧菌母液15ml，摇匀并封口，置于28C培养暖房中培养5—7天，当效价达105-108/ml时，得到噬菌蛭弧菌生态制剂。