[发明专利]克隆有鲑鱼降钙素基因的变铅青链霉菌的构建方法

摘要

本发明涉及克隆有鲑鱼降钙素（ＳＣＴ）基因的变铅青链霉菌的构建方法。本发明采用基因工程技术，以质粒ＰIJ680为载体。其中包括采用ＰＣＲ（多聚酶反应）扩增技术，分别扩增获得鲑鱼降钙素（ＳＣＴ)基因和分泌信号肽melc1基因；通过T4DNA连接酶将ＳＣＴ基因、melc1、基因和PUC19质粒ＤＮＡ连接，转化至大肠杆菌制备获得ＳＣＴ－melc1ＤＮＡ片段；该片段与链霉菌载体质粒PIJ680连接后，通过转化使其克隆至变铅青链霉菌ＴＫ５４，挑选抗硫链丝菌素的转化子，提取重组质粒，得到重组质粒PMS680，获得了克隆有鲑鱼降钙素基因的变铅青链霉菌ＴＫ５４－ＭＳ６８０，（含有重组质粒PMS680），将该克隆菌株进行发酵培养，即可获得高效分泌表达的鲑鱼降钙素，本工程菌遗传性稳定。$#!

主权项

1、克隆有鲑鱼降钙素基因的变铅青链霉菌的构建方法，包括PCR扩增、两个连接步骤、转化、挑选转化子、提取重组质粒和经确证后得到所需菌种五个步骤，其特征在于：(1)PCR扩增：根据已知蛙鱼降钙素基因核苷酸序列设计引物P1和P2，以鲑鱼DNA为模板，扩增获得鲑鱼降钙素基因，扩增反应采取两步不同条件循环方式，前五次循环为90-95℃变性1-3分钟，40-45℃退火1-2分钟，70-75延伸1-2分种；后二十五次循环为：90-95℃变性1-3分种，50-55℃退火1-3分种，70-75℃延伸1-2分种，最后在70-75℃延伸8-15分种；根据分泌信号肽melc1，核苷酸序列设计了引物P3和P4，以pIJ702DNA为模板，扩增获得了分泌信号肽melc1编码基因；扩增反应采取两步不同条件循环方式，前五次循环为90-95℃变性1-3分钟，30-40℃退火1-3分钟，70-75℃延伸1-2分钟，后二十五次循环为：90-95℃变性1-3分钟，40-45℃退火1-2分钟，70-75℃延伸1-2分钟，最后在70-75℃延伸8-15分钟；(2)SCT-melc1DNA片段的连接：PCR扩增后获得的117bPDNA片段，经序列分析确证为SCT编码基因，用限制性内切酶PstI和BamHI酶切；PCR扩增后获得的370bPmelc1编码基因，经序列分析确证为melc1编码基因，以BcII和Psil进行酶切；以Ecom-BamHI酶切puc19质粒，以3-5∶3-5∶1-2浓度比，在加入T4DNA连接酶后进行连接，按Sambrook等人方法将连接的DNA转化至大肠杆菌JM109，在含有50-100微克氨苄青霉和X-gal，IPTG的琼脂平板上，从白色菌落挑选转化子，提取重组质粒puc109-mel-SCT，经SaCI-Xba1双酶切，获得一定数量的melc1-SCTDNA片段；(3)SCT-melc1DNA片段与链霉菌载体pIJ680的连接：将上述SCT-melc1DNA片段与SaCI-XbaI酶切的链霉菌载体质粒pIJ680以3-5∶1的浓度比例在T4DNA连接酶切作用下，按常规方法进行连接；(4)转化：采用(3)步骤中连接的重组DNA，以变铅青链霉菌TK54的原生质体为受体，按照Hopwood等报道的方法，将连接的DNA转化至该受体菌中；(5)挑选转化子及提取重组质粒：以含25mg/ml硫链丝菌素的R2琼脂平板桃选含重组质粒的转化子，采用Katz的快速碱变性方法提取含重组质粒的转化子，将经琼脂糖凝胶电泳确定为重组质粒的DNA用限性内切酶BstEll、PstI、SaII和SphI分别进行酶切后，经琼脂糖凝胶电泳确证为插入SCT-melc1DNA片段的重组质粒pMS680，其表达产物经高压液相色谱分析、酶免实验、大鼠血清钙降低等实验确证，含有重组质粒pMS680的变铅青链霉菌TK54-MS680为鲑鱼降钙素的基因工程菌，其命名及保藏号为StreptomyceslividansTK54-MS680，CGMCCNO0262。