[发明专利]含硒抗体酶的制备方法

摘要

本发明属于高活力含硒抗体酶的制备方法。$本发明提出一种新的抗体酶设计理论，设计系列结构合理的半抗原，通过单克隆抗体制备技术得到由底物结合部位和催化部位共同组成活性中心疏水腔的单抗，然后用ＮａＨＳｅ代替硒化氢将催化基团定量引入到疏水腔中，从而得到活力高于天然含晒谷胱甘肽过氧化物酶的抗体酶。$#!

主权项

1．一种活力高于天然含硒谷胱甘肽过氧化物酶的含硒抗体酶的制备方法，其特征在于：Ⅰ半抗原的设计与合成选择一组谷胱甘肽过氧化物酶底物谷胱甘肽的衍生物作为制备含硒抗体酶的系列半抗原，结构如下：其中R为碳个数1-4的疏水性基团，包括甲基、乙基、丙基、正丁基、异丁基；合成分为两步：首先GSH的巯基与2，4-二硝基氯苯在0℃反应，合成出含硒抗体酶Sec-4A4的半抗原S-二硝基苯取代的谷胱甘肽，然后再与1-4碳相应的醇包括甲醇、乙醇、丙醇、正丁醇、异丁醇等反应，将0.5～3.0ml?1-4碳的醇冷却至0～-10℃，分批加入0.1～0.3ml?SOCl2，加入0.2～0.4克S-二硝基苯取代的谷胱甘肽室温放置2～4小时，补加3～10ml醇溶液，70～130℃回流30～60分钟，反应液在4～-30℃冷却，有固体析出，再用相应醇溶液重结晶，即得到疏水性较强的纯品半抗原S-二硝基苯取代的谷胱甘肽二酯；Ⅱ全抗原的合成6～12mg?BSA与4～10mg半抗原溶于磷酸钠缓冲液，慢慢滴入0.3～1.0ml戊二醛溶液，反应10～15小时，加入6～15mg甘氨酸终止反应，用磷酸钠平衡的交联葡聚糖凝胶层析柱分离，收集第一峰为全抗原；Ⅲ单克隆抗体的制备将全抗原1.0～3.0mg/ml与福氏完全佐剂以体积比1∶1混合，每只BALB雌鼠注射0.2ml，两周后进行第二次免疫，四周后换成福氏不完全佐剂，第六周不加佐剂免疫，融合前三天不加佐剂加强免疫；鼠脾细胞与骨髓瘤细胞10∶1比例混合，在聚乙二醇/二甲亚砜作用下融合一分钟，播种在已加入巨噬细胞的培养板上，用含次黄嘌呤、氨基喋呤和胸苷培养基在37℃二氧化碳培养箱中培养，用酶联免疫标记方法检测，两次呈阳性的细胞株进行克隆，将腹水经过预处理、45％硫酸铵沉淀、二乙基氨基乙基-纤维素离子交换柱层析、聚丙烯酰胺凝胶过滤、蛋白G亲和层析将单抗纯化，经电泳检验为一条带，分子量为15万道尔顿；Ⅳ催化基团的引入0.5～1.0×10-8mol/L单抗溶在pH?7.0磷酸钠缓冲液中，加入3.0～6.1×10-8mol/L?PMSF，室温振荡1～1.5小时，在高纯氮保护下加入1.0～2.1×10-7mol/L?NaHSe溶液，35～40℃保温36～40小时，将反应液经过柱层析除盐后，冻干即得在单抗可变区上既有GSH结合部位、又有Sec的催化部位、活力达到天然谷胱甘肽过氧化物酶的1.6到10倍。