[发明专利]用于重组腺伴随病毒生产的全功能辅助病毒的产生及其用途

摘要

本发明包括了一种装载了2型腺伴随病毒(AAV－2)rep－cap基因的重组单纯疱疹病毒(HSV1－rc)的产生方法及其在重组腺伴随病毒(rAAV)生产中的用途。这种重组单纯疱疹病毒能提供rAAV质粒在细胞内复制和包装成rAAV毒粒所需的全部辅助功能,并能用于rAAV的大量制备。HSC1－rc的产生是在对一套含有HSVl病毒全基因组的粘性质粒(SetC粘粒,包括cos6,cos14,cos28,cos48,cos56)进行改造的基础上实现的。首先,用重组DNA技术将AAV－2rep－cap基因插入基中一个粘粒的HSV－1基因组中,例如插入cos6的HSV1UL2基因中构建成cos6－rcΔUL2;插入cos56的HSV1UL44基因中构建成cos56－rcΔUL44。然后,将插入了rep－cap的重组粘粒与相应的其余4个粘粒经酶切切去粘粒骨架部分后用脂质体方法共转染HSV11敏感细胞如BHK－21,5个HSV1片段在细胞中发生同源重组而产生HSV1－rc。用HSV1－rc感染rAAV载体质粒转染的细胞或稳定携带rAAV载体质粒的细胞株,就能产生大量有感染性的rAAV毒粒。用这种方法产生的rAAV能将外源基因导入哺乳动物细胞中并表达。

主权项

本发明属于病毒基因工程领域，具体涉及大量生产重组腺伴随病毒(rAAV)所需的复制和包装功能系统。本发明涉及一种装载了2型腺伴随病毒(AAV-2)rep-cap基因(4.3kb)的重组单纯疱疹病毒(HSV1-rc)的产生方法及其在重组腺伴随病毒(rAAV)生产中的用途。1.本发明提出的能提供rAAV复制和包装所需的全部功能的辅助病毒HSV-rc的制备策略，其特征在于，通过对一套含有HSV-1全基因组的粘粒(SetC)进行基因操作，将rep-cap基因插入到在HSV-1基因组片段中，然后将其与其余4个粘粒共转染细胞，获得含有rep-cap的重组HSV-1。该重组病毒既能作为产生rAAV所需要的辅助病毒功能，又能提供rep-cap基因的功能，因此是一种生产rAAV的全功能辅助病毒。2.本发明所构建的2种HSV-rc，其特征在于rep-cap基因分别插入在HSV-1UL2基因(编码尿嘧啶DNA糖基化酶)和HSV-1UL44基因(编码糖蛋白C)的XbaI位点，获得的重组病毒分别称为HSV-rc/ΔUL2和HSV-rc/ΔUL44。3.在粘粒所载的HSV-1基因组片段中插入rep-cap基因。利用cos6及cos56粘粒所装载的HSV-1基因组片段中各有一个Xbal单酶切位点(分别位于UL2和UL44基因内)的特点，用XbaI将rep-cap基因从pSub201中切出，分别插入cos6及cos56的Xbal位点中(插入方向不限定)，构建成重组粘粒cos6-rcΔUL2及cos56-rcΔUL44。两种重组粘粒均寄存于大肠杆菌DH5α株(MAXEFFICIANCYDH5α，GIBCO#18258-012)中。含此两个重组粘粒的菌株已于1998年9月24日保存于中国微生物菌种保藏委员会普通微生物中心，登记入册编号为CGMCCNo.0361-1，2。4根据权利1、2、3，通过对含有HSV-1全基因组的一套粘粒进行基因操作，可将rep-cap插入HSV-1基因组的其它部位，生成插入部位不同的重组HSV-rc。5.根据权利要求1、2、3，可在在2个以上部位插入rep-cap基因的重组HSV-1病毒。6.用本发明的HSV-rc重组病毒感染含有rAAV载体元件的细胞株生产rAAV的方法。