[发明专利]基因表达幽门螺杆菌细胞毒素相关基因A蛋白抗原制备工艺

摘要

本发明首先选用在细菌中产生融合蛋白和完全天然蛋白的质粒载体;在确定质粒载体后,使用与之相适应的大肠杆菌受体菌,以获得高表达率的基因工程菌;然后制备目的DNA;目的DNA与质粒DNA重组(连结)后转化大肠杆菌;最后进行CagA蛋白抗原的表达和纯化。基因表达的CagA为近C末端蛋白抗原,其分子量大小随不同菌株而定,为27～38Kda。本发明应用于消化道疾病的诊断预报和预防治疗的制备中,能为临床消化道疾患的诊断及预报提供依据。

主权项

1.一种基因表达幽门螺杆菌细胞毒素相关基因A蛋白抗原的制备工艺，在基因工程中质粒的制备和纯化、限制性内切酶水解、酶切后DNA纯化、DNA连结、连结物转化大肠杆菌受体菌、转化子筛选，按一般常规操作或采用市售商品试剂及试剂盒进行操作；其特征在于，首先选用在细菌中产生融合蛋白和完全天然蛋白的质粒载体；在确定质粒载体后，使用与之相适应的大肠杆菌受体菌，以获得高表达率的基因工程菌；然后制备目的DNA：以CagA阳性菌染色体DNA为模板，用聚合酶链反应(PCR)扩增目的DNA片段；(1)DNA模板采用国际CagA阳性标准菌株，以及用国际标准菌株证实的国内外CagA阳性流行菌株的菌体染色体DNA作PCR扩增模板；(2)引物选用CagA基因核苷酸2229-3018bp序列及根据载体酶切点的序列设计引物，使插入目的DNA表达符合读格；(3)扩增反应在0.5ml灭菌离心管内混合，其中灭菌水30μl10X扩增缓冲液10μ14种dNTP混合物，每种浓度1.25mmol/L16μl引物1(溶于5μl水)100pmol引物2(溶于5μl水)100pmol模板DNA1ug加水至终体积100μl其中10X扩增缓冲液：500mmol/LKCl100mmol/LTris.HCl(PH8.3室温)15mmol/LMgCl20.1％明胶(4)扩增参数上述混合液在94℃加热5分钟，加入2uTaq聚合酶，用100μl液体石蜡复盖反应混合液上，然后按以下参数进行扩增：循环变性退火聚合首轮循环94℃5分钟50℃2分钟72℃3分钟后续循环94℃1分钟50℃2分钟72℃3分钟末轮循环94℃1分钟50℃2分钟72℃10分钟循环25～30次；目的DNA与质粒DNA重组(连结)后转化大肠杆菌；最后进行CagA蛋白抗原的表达和纯化：重组质粒转化后，经小量培养筛选表达率高的重组转化子作为基因工程菌，基因工程菌经增菌及IPTG诱导后表达CagA蛋白抗原；基因表达的CagA为近C末端蛋白抗原，其分子量大小随不同菌株而定，为27～38Kda：CagA蛋白抗原的纯化需根据载体的情况使用融合蛋白抗体、相应抗体。亲和层析柱或HPLC进行。