[发明专利]将基因整合至哺乳动物细胞特定位点的方法及所用载体

摘要

本发明涉及经由同源重组将所需DNA位点特异性地整合至哺乳动物细胞靶位点的方法,此方法能可再现地选择细胞系,在所述细胞系中,所需DNA被整合至已用标记质粒标记的预定的转录活性位点。此方法特别适用于产生哺乳动物细胞系,所述细胞系可高水平分泌哺乳动物蛋白质,尤其是免疫球蛋白。本发明也提供了此克隆方法中所用的载体和载体组合。

主权项

1.在哺乳动物细胞基因组的靶位点插入所需DNA的方法，所述方法包括下列步骤：(i)用第一个质粒(“标记质粒”)转染或转化哺乳动物细胞，所述质粒含有下列序列：一个不常见的限制性内切核酸酶序列(a)对哺乳动物细胞基因组而言为异源的DNA区域，当该区域整合至哺乳动物细胞基因组时，可为同源重组提供独一无二的位点；一个不常见的限制性内切核酸酶序列(b)编码第一个选择标记蛋白部分的DNA片断；和一个不常见的限制性内切核酸酶序列(c)至少一种其它选择标记DNA，该DNA有助于选择被标记质粒成功整合的哺乳动物细胞；(ii)选择含有标记质粒的细胞，所述质粒已整合至该细胞的基因组中；(iii)用第二个质粒(“靶向质粒”)转染或转化所述选定细胞，所述质粒含有下列序列：一个不常见的限制性内切核酸酶序列(a)DNA区域，该区域与标记质粒中独一无二的区域相同或与其具有足够的同源性以使所述DNA区域能经由同源重组与所述DNA重组；一个不常见的限制性内切核酸酶序列(b)编码与标记质粒中所含选择标记相同的选择标记部分的DNA片断，其中仅当所述片断与标记质粒中所含的所述选择标记DNA片断联合表达时，才会产生由所述DNA编码的活性选择标记蛋白；和一个不常见的限制性内切核酸酶序列(iv)通过筛选第一个选择标记蛋白的表达选择出含有靶向质粒的细胞，所述质粒整合至靶位点。