[发明专利]用于有效反转录丙型肝炎病毒(HCV)RNA的寡核苷酸引物及其使用方法

说明书

本发明涉及用于检测生物样品中核酸序列、特别是来源于感染性微生物的序列的改进方法。

丙型肝炎病毒是一种世界范围内的经非肠道传染的病毒，它可导致大量输血后肝炎情况的发生和大量的偶发性(或群体感染性)肝炎情况发生。据估计超过1％的世界人口感染有HCV。HCV的感染与急性肝炎(通常是轻度的)、慢性肝炎(各种重度的)、肝硬变和随后发生的肝细胞癌有关。

通常将HCV分在黄病毒科中的一种单独的属中(Hepacivirus)。它的基因组由约9,500个核苷酸的正链RNA分子组成，其中所述的核苷酸带有单一的较大可读框(ORF)，该可读框可编码约3,000个氨基酸的多蛋白前体。所述的较大ORF位于约340个核苷酸的5’非编码(NC)区域之前，它是基因组中最高度的保守区。ORF的5’区域(在5’-至-3’方向上)可编码一种衣壳蛋白、两种包膜糖蛋白(E1和E2)以及一种未知功能的小蛋白(P7)。ORF的3’部分可编码非结构性蛋白，它们包括蛋白酶、蛋白酶解旋酶的双功能蛋白、RNA聚合酶和调节肽类。

来自全世界的对HCV编码序列的分析结果已经揭示出在各个病毒分离物中的相当可观的序列变化形式。此外，对来自各个患者的HCV序列分析结果已经证实这些病毒以所谓的“准种”的形式传播，它们含有相关但不相同的序列。人们认为存在于分离物中和各个患者体内的变化形式是由于病毒编码的RNA依赖性RNA聚合酶的低确限度所导致的结果。HCV遗传变异性的程度对预防、诊断和控制感染具有重要的意义。

HCV感染的血清诊断一般通过市售可得的酶免疫测定物(EIA)来确定，所述的酶免疫测定物可检测结合重组HCV蛋白或肽的抗体。阳性EIA结果可由一种重组免疫印迹检测试验(RIBA)来证实，但是无论是EIA还是RIBA检测试验都不可能从现在的感染情况中区分过去。由于循环病毒的效价一般较低，所以还没有成功地开发出对病毒蛋白的直接检测法。此外，以抗体为主的检测法不能在通常接触后2-3个月内检测出HCV的感染。

因此，本领域中存在一种对HCV的改进检测方法的需求，这些方法的敏感性足以在患者接最初触HCV后几天内检测出HCV病毒血症。

因此，一方面，本发明涉及一种用于反转录生物样品中丙型肝炎病毒(HCV)RNA的方法。该方法包括下列步骤：

(a)在寡核苷酸引导与至少部分RNA互补的DNA的合成的条件下，使来源于所述样品的RNA与寡核苷酸接触；

其中所述的寡核苷酸选自：

(i)5’-AGGCCAGTATCAGCACTCTCTGCAGTC-3’(57R27)<SEQ IDNO.：1>、

(ii)5’-GTATCAGCACTC-3’(66RT12)<SEQ ID NO.：2>、

(iii)5’-AGTATCAGCACTC-3’(66RT13)<SEQ ID NO.：3>、

(iv)5’-CAGTATCAGCACTC-3’(66RT14)<SEQ ID NO.：4>、

(v)5’-CCAGTATCAGCACTC-3’(66RT15)<SEQ ID NO.：5>、

(vi)5’-GCCAGTATCAGCACTC-3’(66RT16)<SEQ IDNO.：6>、和

(vii)上述任意寡核苷酸的任意组合物。

在另一方面，本发明涉及一种用于检测生物样品中存在的丙型肝炎病毒(HCV)RNA的方法。该方法包括下列步骤：

(a)用来源于所述样品的RNA作模板并用与所述RNA中含有的一段序列互补的寡核苷酸作引物来进行反转录反应，从而产生HCV特异性反转录产物，其中所述的引物选自：

(i)5’-AGGCCAGTATCAGCACTCTCTGCAGTC-3’(57R27)<SEQ IDNO.：1>、

(ii)5’-GTATCAGCACTC-3’(66RT12)<SEQ ID NO.：2>、

(iii)5’-AGTATCAGCACTC-3’(66RT13)<SEQ ID NO.：3>、

(iv)5’-CAGTATCAGCACTC-3’(66RT14)<SEQ ID NO.：4>、

(v)5’-CCAGTATCAGCACTC-3’(66RT15)<SEQ ID NO.：5>、

(vi)5’-GCCAGTATCAGCACTC-3’(66RT16)<SEQ ID NO.：6>、和