[发明专利]通过载体核酸增强核酸扩增的特异性

说明书

本发明涉及扩增核酸的方法，尤其是用于传染性微生物的诊断试验中的方法。

使用聚合酶链式反应(PCR)的对核酸序列的扩增需要至少两个与靶核酸中的不同序列杂交的寡核苷酸扩增引物。通常，希望避免使用在其3’末端具有同源序列的寡核苷酸引物。具有同源3’末端的引物可能相互杂交，产生各种扩增人为结构，包括引物二聚体。

一旦所有PCR反应成分被混合，但是在扩增开始前，通过由于在反应混合物中镁的存在，低温下稳定引物杂交物，可发生具有3’末端互补性的引物的杂交。在室温或低于室温下，通过DNA聚合酶延伸杂交的引物导致引物-二聚体的形成。与引物和聚合酶的靶核酸发生竞争，产生的引物-二聚体产物在PCR期间将扩增。如果在起始期形成引物-二聚体产物，该产物随后的PCR扩增可竞争超过指定的靶，导致(i)阴性的阴性结果，即当实际上序列存在时，样品看来缺乏特定的序列或(ii)“未检测出”的结果，即从内部阳性对照中没有获得信号。

除开引物组的一级序列，引物-二聚体形成的主要贡献者为：分析特异性标准混合物(ASMM)中高摩尔水平的引物；加入反应物的顺序(例如加入ASMM，接着MgCl₂溶液，随后靶/样品将促进引物-二聚体的形成)；将MgCl₂加入到ASMM至加入靶之间的保温期；和在PCR热循环开始前，保温全部扩增反应混合物，即包含所有扩增所需成分，包括靶和聚合酶的时间段。

业已知一些减少引物和聚合酶的核酸扩增混合物中引物-二聚体形成的方法。这些方法包括；

1.仔细设计PCR引物以将其与特定反应混合物中所有其它引物的3’-末端同源性减至最小。然而，在多重反应，即包含一些针对不同的靶核酸序列的扩增引物对的反应中，该方法是困难的。而且，即使使用一个引物对，由于其它制约因素，如相同或保守的区域，实现它可能很困难。

2.在制备分析特异性反应混合物后立即进行热循环/扩增反应以减少可用于引物-二聚体形成的时间。然而，这在实践中可能很困难，尤其是如果将筛选大量的样品时。

3.改变加入试剂的顺序以使可能的引物-二聚体去稳定。例如，加入MgCl₂作为最后的成分可减少引物-二聚体的形成。然而，该方法是不希望的，因为(i)它未消除引物-二聚体的形成，(ii)它不方便，和(iii)它可能导致来自样品中的靶对氯化镁溶液的污染。

4.使用“触发”抗体，它为在可能形成引物-杂交物的温度下阻断聚合酶活性，但在高温下被灭活的抗聚合酶抗体。因此，聚合酶仅在太高而不能形成引物-二聚体的温度下活化(参见美国专利号5,338,671和5,587,287；和欧洲专利申请号0592935)。然而，由于抗体/聚合酶结合是一个平衡过程，不能实现所有聚合酶的完全结合。因此，基于抗体的PCR触发不需是100％有效，尤其是在复杂的扩增反应中。

5.进行热启动PCR(Chou等，核酸研究20：1717-1723，1992)。这包括将除开热稳定DNA聚合酶外的所有成分加入至反应混合物中，用产物变性步骤启动反应，接着打开反应试管并将聚合酶加入至反应混合物中。虽然该方法在减少引物-二聚体形成中有效，但由于许多原因，它在实践上是不可行的。最明显的是，它极为麻烦并明显增加扩增子遗留的可能性。

6.使用热稳定DNA聚合酶进行热启动PCR，如AmpliTaq Gold，它直至加热才相对活化(参见欧洲专利申请号624641和美国专利号5,4910,86)。然而，AmpliTaq Gold在低温下保留明显残余的酶活性，因此仍易产生副产物。

这些方法可预测性地认为在消除引物-二聚体形成中均不成功。仔细的引物设计和AmpliTaq Gold的使用或触发抗体并结合Taq聚合酶可减少引物-二聚体形成，但未消除它。因此，现有技术需要改进的用于在PCR反应，尤其是多重反应中进一步减少或消除引物-二聚体形成的方法。

本发明提供提高靶核酸扩增特异性的方法。它可用于所有需要特异于靶和核酸聚合酶的寡核苷酸扩增引物的反应中。因此，在一个方面，本发明涉及一种在扩增反应中提高靶核酸扩增特异性的方法，其中扩增反应混合物包含一种或多种特异于靶的寡核苷酸扩增引物，核酸聚合酶和一种或多种镁盐，该方法包括制备包含一种或多种引物和载体核酸的引物-载体混合物，并将引物-载体混合物与靶核酸，一种或多种镁盐和聚合酶接触。