[发明专利]生长抑素基因工程体及其活载体疫苗

权利要求书

1、用于生长抑素(SS)基因工程活载体疫苗的基因工程体——重组痘苗病毒(vv-HBs/SS)，其构建方法为：

1、1)SS基因合成和克隆SS为14个氨基酸残基组成的短肽，其氨基酸序列和密码子如下：

 1    2    3    4    5    6    7    8    9   10   11   12   13   14

Ala  Gly  Cys  Lys  Aan  Phe  Phe  Trp  Lys  Thr  Phe  Thr  Ser  Cys5′-CCT  GGC  TGC  AAG  AAC  TTC  TTC  TGG  AAG  ACT  TTC  ACA  TCC  TGT-3′

用380型DNA自动合成仪合成A52和A23 2个两端有酶切位点的SS基因片段：A525′-GGATCCGATGGCTGGCTGCAAGAACTTCTTCTGGAAGACTTTCACATCCTGT

                                     3′-AAGTGTAGGACAATCATTCGAAA-5′

                                                             A23

将2条合成单链摩尔等混合，退火，补齐，即成两端有粘性末端的SS基因，并将其基因克隆于pUC12，获得带SS基因的pUC12-SS质粒：

BamHI       1     2    3    4    5    6    7    8    9   10   11   12   13   14   stop5′-GGATCCG ATG GCT  GGC  TGC  AAG  AAC  TTC  TTC  TGG  AAG  ACT  TTC  ACA  TCC  TGT  TAG TAAGCTTT-3′

 CCTAGGC  TAC CGA  CCG  ACG  TTC  TTG  AAG  AAG  ACC  TTC  TGA  AAG  TGT  AGG  ACA  ATC  ATTCGAA

                                                                                           HindIII

1、2)SS基因与HBsAg融合基因的构建  从带HBs基因的pWR13-HBs/4经改造成PWR13-HBs/6后，从中切下7000bp的HBs基因片段，将其插入pUC₁₂-ss质粒，构建成带HBs/ss嵌合基因的pUC₁₂-HBs/ss质粒；

1、3)HBs/ss表达质粒的构建  将HBs/ss嵌合基因克隆到痘苗病毒表达载体pGJP-5的启动子P7.5之后，获得pGJP-HBs/ss质粒；

1、4)带HBs/ss基因的重组痘苗病毒克隆  将pGJP-HBs/ss转染，经痘苗病毒感染的CV-1细胞，由于该质粒中外源基因插入部位的两侧带有痘苗病毒TK基因的同源序列，因同源重组而获得带HBs/ss基因的重组痘苗病毒(vv-HBs/ss)。

2、用权利要求1所述生长抑素基因工程体制成的基因工程活载体疫苗(激生1号疫苗)，其配制方法如下：

2、1)鸡胚苗的接种、收获  取生产用重组痘苗病毒(vv-HBs/ss)毒种，用灭菌生理盐水稀释1000-10000倍，取0.2ml接种于绒毛尿囊膜上，置35℃～37℃继续孵育，每天照蛋1-2次，取48小时至120小时死胚及120小时活胚，无菌收集有痘斑的鸡胚绒毛尿囊膜，置无菌容器内结冻保存，用于制苗；

2.2)半成品检验  取样作无菌检查，应无细菌生长；

2.3)配苗  将合格的绒毛尿囊膜称重，按2.5ml/g量加入5％蔗糖脱脂奶，制成匀浆，滤过；

2.4)分装、冻干  将混合后的疫苗定量分装，迅速进行冷冻真空干燥，按《制品冷冻真空干燥法》进行；

2.5)瓶器与包装  按《兽医生物制品规程》进行。