[发明专利]新的基因工程抗体真核高效表达系统、其制备方法及其应用

权利要求书

1、一种制备基因工程抗体真核高效表达系统的方法，所述的方法包括分别制备抗体可变区基因通用型配套克隆载体，抗体基因真核表达的中间表达载体以及抗体通用型真核高效表达载体以构成基因工程抗体真核高效表达系统，所述方法的特征在于：

1)将选择标志基因和可扩增选择标志基因包括在同一表达载体中，

2)在表达载体中同时采用弱化的启动子驱动选择标志基因和可扩增选择标志基因的表达，

3)在表达载体中应用氨基酸序列为NH₃-Met-Tyr-Phe-Ser-Ala-Ile-Val-Ser-Ala-Ser-Leu-Ser-COOH的肽作为抗体分泌信号肽，

4)在表达载体中使用翻译型增强子序列，

5)在表达载体中包括强启动子以驱动目的基因的表达，同时在表达载体中还包括人抗体恒定区基因组序列和强转录终止子。

2、如权利要求1所述的方法，其中所述的选择标志基因选自氨基糖苷磷酸转移酶(neo)基因或胸苷激酶(tk)基因、潮霉素B磷酸转移酶(hyg)基因、黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(gpt)基因、天冬酰胺合成酶(AS)基因，所述的可扩增选择标志基因选自二氢叶酸还原酶(dhfr)基因和谷氨酰胺合成酶(GS)基因。

3、如权利要求1所述的方法，其中所述的弱化的启动子为弱化的SV40启动子。

4、如权利要求3所述的方法，其中所述的弱化的SV40启动子是通过删除SV40启动子72bp大小的一段序列获得，该72bp大小的序列的核苷酸序列如下所示：5’-ATCTCAATTAGTCAGCAACCAGGTGTGGAAAGTCCCCAGGCTCCCCAGCAGGCAGAAGTATGCAAAGCATGC-3’(SEQ ID NO：1)。

5、如权利要求1所述的方法，其中所述的翻译型增强子为核苷酸长度为163bp的鼠VEGF基因5’—非翻译区的SP163序列，该翻译型增强子核苷酸序列如下所示：5’-AGCGCAGAGGCTTGGGGCAGCCGAGCGGCAGCCAGGCCCCGGCCCGGGCCTCGGTTCCAGAAGGGAGAGGAGCCCGCCAAGGCGCGCAAGAGAGCGGGCTGCCTCGCAGTCCGAGCCGGAGAGGGAGCGCGAGCCGCGCCGGCCCCGGACGGCCTCCGAAACC-3’(SEQ ID NO：2)。

6、如权利要求1所述的方法，其中所述的强启动子选自人巨细胞病毒立早基因启动子P_hCMV-IE或SV40早期基因启动子P_SV40-E、Rous肉瘤病毒LTR启动子P_RSV-LTR，强转录终止子选自牛生长激素基因聚腺苷化位点BGH polyA或SV40聚腺苷化位点SV40 polyA，人抗体恒定区基因组序列选自Cγ1、Cγ2、Cγ3、Cγ4或Cκ、Cλ。

7、由权利要求1—6任一项所述的方法制得的基因工程抗体真核高效表达载体系统。

8、如权利要求1所述的基因工程抗体真核高效表达系统，其为pYR-GKES表达系统，其包括克隆载体pYR-GCVH、pYR-GCVL、中间表达载体pYR-SV2-rdhfr、pYR-SV2-rneo和表达载体pYR-GSEVH、pYR-GSEVL、pYR-GCEVH、pYR-GCEVL，各载体具有图1-图6所示的结构。

9、权利要求7或8所述的基因工程抗体真核高效表达系统在制备和生产各种基因工程抗体中的应用，其中所述的基因工程抗体包括各种类型的嵌合抗体、改形抗体、全人源化抗体、小分子抗体、胞内抗体、双特异性抗体及其它的类似物、突变物、合成物以及衍生物。