[发明专利]新的基因工程抗体真核高效表达系统、其制备方法及其应用

说明书

本发明涉及一种新的构建基因工程抗体真核高效表达系统的方法，以及由此方法构建的一种基因工程抗体真核高效表达系统及其应用。确切地说是本发明涉及一种用现代生物学技术构建并建立在真核细胞中高产量表达各种基因工程抗体的表达系统方法，以及由此方法制备的表达系统在多种基因工程抗体的制备和高产量生产中的应用。

自1975年Kohler和Milstein创立杂交瘤技术生产单克隆抗体(简称单抗)以来，众多单抗被研制成功并广泛地应用于医学临床的诊断和治疗疾病中。但在广泛的临床应用中发现，鼠单抗用于人体治疗疾病疗效不佳，且出现严重的副作用，其主要原因有两个：(1)因鼠单抗对人体的异源性，用于人体会产生人抗鼠抗体反应(HAMA)。(2)抗体分子较大，难以进入肿瘤组织发挥治疗作用。随着现代分子生物学及免疫学的迅速发展，以及DNA重组技术的突起及日趋成熟，80年代初，人们可根据所需要的特性，采用基因工程技术改造鼠单抗或创造新的抗体及抗体片段，这些经过基因工程技术改造或创造的抗体及抗体片段通称为基因工程抗体。基因工程抗体可分成两大类：即全分子抗体和小分子抗体。到目前为止全分子抗体包括有嵌合抗体、改形抗体、全人源化抗体、双特异性抗体及它们被修饰的类似物、衍生物、突变物和合成物。小分子抗体种类繁多，包括Fv(单域抗体)、scFv(单链抗体)、dsFv(双价单链抗体)、Fab、Fab′、F(ab′)₂、胞内抗体以及它们与其它效应分子的融合蛋白、衍生物等。研制基因工程抗体，无论是全分子还是小分子抗体，首先是从鼠单抗中克隆、鉴定有功能的单抗抗体基因(也可通过其它途径获得抗体基因，如抗体库技术)，再将抗体基因采用DNA重组技术克隆到能使其表达出蛋白质即抗体的表达载体中(称为抗体重组表达载体)，再将抗体重组表达载体转导到特定的宿主工程细胞中，培养并筛选生产抗体的工程细胞，从而获得所需的被改造或新创造的抗体。由上可见，基因工程抗体的生产最重要的是需要有基因工程抗体的表达系统，目前能表达和生产基因工程抗体的表达系统主要分为两类：一类是原核表达系统，在如大肠杆菌这样的原核细胞中表达生产抗体；另一类是真核表达系统，多在哺乳动物细胞如CHO、sp2/0、NSO等细胞中表达生产抗体。这两种表达系统具有各自的特点，原核表达系统成本低、表达产量高，但无糖基化、生物活性低、难以表达全分子抗体，因此原核表达的抗体不能用于临床治疗疾病；真核表达系统表达抗体有糖基化、生物活性高、既能表达全分子抗体也能表达小分子抗体，因而用于医学临床上治疗疾病的抗体必须是真核表达系统表达生产的，但真核表达系统表达抗体产量低，因而成本高，难以获得大量的抗体，而临床治疗疾病所需抗体量较大，因此真核表达系统表达抗体产量低严重阻碍了基因工程抗体应用于临床治疗疾病。为了使有临床应用价值的单抗能更广泛地用于人类疾病的治疗，自90年代，科学家们和商家均致力于研制能高产量表达基因工程抗体的真核表达系统，到目前为止国外有5种能高表达基因工程抗体的真核表达系统构建成功，并用于数种基因工程抗体的生产，而国内尚无一例基因工程真核高效表达系统研制成功。美国目前已批准7种基因工程抗体产业化上市销售，用于临床治疗疾病，还有数十种在II、III期临床试用，这些基因工程抗体的生产多采用以上5种真核表达系统，因此基因工程抗体真核高效表达系统的研制成功，大大地推动了基因工程抗体的发展和产业化，同时以上情况也显示出基因工程抗体在医学临床治疗疾病中有着广泛的应用前景和重要的应用价值。但目前国外研制成功的5种基因工程抗体真核表达系统还存在着各种问题，都不够理想。第一种由Beidler等人(Beidler CB等人，J Immunol 1988；141：4053)研制成功的抗体真核表达系统是采用小鼠骨髓瘤细胞sp2/0作为表达细胞，采用人抗体基因组恒定区基因序列和鼠单抗基因组可变区基因序列组成的真核表达载体，后者自带有小鼠抗体的启动子、增强子、分泌信号肽、剪接位点等调控表达的序列。这种表达系统表达抗体的产量可达32μg/ml，但这种系统的缺陷是抗体可变区基因基因组序列个体差异大，不同的抗体表达产量相差很大，采用这种载体系统只有1-2家报道可较高水平表达抗体，其余绝大多数报道其产量仅达2μg/ml，因此该载体系统缺乏通用性和普遍性，其原因可能是鼠单抗自带的表达调控序列并非都能实现高表达。其次这种载体构建操作复杂、成本高、周期长、所用的表达细胞sp2/0不适宜于产业化生产。第二种基因工程抗体真核高效表达系统由Bebbington等人报道(BebbingtonFD等人，Biotechnology 1992；10：169)，该系统选用GS基因(谷氨酰胺合成酶基因)作为可扩增选择标志基因，用MSX(MethionineSulphoximine)加压扩增表达，用小鼠骨髓瘤细胞NSO细胞作为表达细胞，其表达产量可达10-15μg/ml。但该表达系统中GS基因对目的基因的共扩增倍数有限，故产量不是太高，最高值能达15μg/ml，此外这种载体系统筛选产生抗体的阳性克隆的筛选条件严格，阳性克隆数量较少，难以获得高产量阳性克隆。第三种，由Shitara等人(Shitara K等人，J Immunol Methods 1994；167：271)报道的高效表达系统，该表达系统是选择大鼠骨髓瘤细胞YB2/0作为表达细胞，dhfr(二氢叶酸还原酶)基因为可扩增选择标志基因，用Moloney病毒的长末端重复序列为驱动目的基因表达的启动子，该系统的最大优点是采用了非常适合表达抗体类外源基因的YB2/0细胞，配合强启动子，可实现较高的基础表达量，但经MTX(氨甲喋呤)加压扩增目的基因表达的扩增倍数较少，只有10倍左右，因此该载体系统的产量表达主要依赖于基础表达水平，但大多数抗体并不能在此载体系统实现高基础表达水平，因此有的抗体能高产量表达，有的则不能高产量表达，其次YB2/0细胞也不适合大规模的产业化生产。第四种是由Dorai等人(Dorai H等人，J Immunol 1987；139：4232)报道的抗体真核高效表达系统，采用sp2/0作为表达细胞，dhfr作为可扩增选择标志基因，通过MTX加压到10^-5mol/L扩增目的基因拷贝数，但此高浓度MTX已达到表达细胞的毒性剂量，致使表达细胞生长缓慢、状态差、不适宜规模化生产，同时细胞易发生突变，退化成不产抗体的细胞，因而不能长期培养、收获抗体，同时扩增表达的倍数也不高。第五种表达系统是由Page等人报道的(Page MJ等人，Biotechnology 1991；9：64)，该系统选择dhfr缺陷型的CHO细胞(中国仓鼠卵巢细胞)作为表达细胞，dhfr基因作为可扩增选择标志基因，采用受专利保护的强启动子β-肌动蛋白基因启动子作为表达目的基因的启动子，采用删除驱动dhfr的SV40启动子中的143bp序列单弱化可扩增选择标志基因等措施实现抗体的高表达。该系统采用了最强的启动子，可实现抗体的高产量表达，但仅在抗体表达的基因剂量和转录效率水平采取了高表达的措施，尚可通过在抗体表达的其它环节(如翻译水平、分泌水平等)采取措施进一步提高表达产量。综上所述，可知目前已研制成功的基因工程真核高效表达系统虽然已提高了抗体的表达产量，达到了能实现产业化的表达水平10μg/ml以上，但还不是理想的表达系统，还存在着各种问题。首先，它们仅用一种或最多3种提高抗体表达水平的措施，而对外源基因表达水平高低所涉及的因素至少包括6个方面，即表达细胞的选择、基因剂量的扩增、基因转录效率的高低、翻译水平效率的高低、加工水平的效率以及分泌水平的效率等等，目前已研制成功的5种抗体表达系统仅在选择表达细胞、提高抗体基因剂量以及转录效率这三个方面采取某些措施来提高表达产量。其次，抗体基因转导表达细胞，整合于细胞染色体后，易缺失筛选标志，不易获得正确的阳性克隆。另外，现有的表达系统缺乏与之配套的通用型抗体基因克隆载体，构建抗体重组表达载体进行抗体表达时操作复杂、耗时、耗力、成本高。