[发明专利]生产L－赖氨酸的棒状菌和制备L－赖氨酸的方法

说明书

本发明涉及具有扩增的lysE基因(赖氨酸输出载体基因)的棒状菌的生产L-赖氨酸的菌株，在这些菌株中，选自包括dapA基因(二氢吡啶二羧酸合酶基因)，lysC基因(天冬氨酸激酶基因)，dapB基因(二氢吡啶二羧酸还原酶基因)和pyc基因的组的附加基因，特别是dapA基因和lysC基因(天冬氨酸激酶基因)得到扩增，尤其是得到超量表达，本发明也涉及制备L-赖氨酸的方法。

L-赖氨酸是商业上重要的L-氨基酸，尤其是用作动物营养中的饲料添加剂。近年来需求量一直稳步增加。

L-赖氨酸由棒状菌，尤其是谷氨酸棒杆菌的生产L-赖氨酸的菌株的发酵过程产生。由于这一产物非常重要，人们不断尝试改进其制备过程。对过程的改进可以涉及牵涉发酵技术的手段，搅拌和氧供给，或营养培养基的组成(如发酵期间的糖浓度)，或产物的检测(如经离子交换色谱)，或微生物自身的内在生产特征。

这些微生物的生产能力的特性通过利用诱变，选择以及突变体选择的方法来改善，以给出对抗代谢物(例如S-(2-氨乙基)半胱氨酸)具有抗性，氨基酸(例如L-亮氨酸)营养缺陷的，并产生L-赖氨酸的菌株。

一些年来重组DNA技术的方法也曾用于通过扩增个体生物合成基因改进谷氨酸棒杆菌的L-赖氨酸生产菌株，并且研究了对L-赖氨酸生产影响。

就此而言，EP-A-0 088 166报道了在赋予对氨乙基半胱氨酸的抗性的DNA片段扩增后生产能力增强。EP-B-0 387 527报道了编码反馈抗性天冬氨酸激酶的lysC等位基因扩增后生产能力增强。EP-A-0 197 335报道了编码二氢吡啶二羧酸合酶的dapA基因扩增后生产能力增强。EP-A-0 219 027报道了编码天冬氨酸半醛脱氢酶的基因扩增后生产能力增强。Pisabarro等(细菌学杂志175(9)，2743-2749(1993)描述了编码二氢吡啶二羧酸还原酶的dapB基因。

也已经研究了主要代谢基因的扩增对L-赖氨酸生产的影响。就此而言，EP-A-0 219 027报道了编码天冬氨酸氨基转移酶的aspC基因扩增后生产能力增强。EP-A-0 143 195和EP-A-0 358 940报道了编码烯醇丙酮酸磷酸羧化酶的ppc基因扩增后生产能力增强。DE-A-19831609报道了编码丙酮酸羧化酶的pyc基因扩增后生产能力增强。

最后，DE-A-195 48 222描述了由lysE基因编码的L-赖氨酸输送载体的活性增加促进赖氨酸生产。

除这些扩增个体基因的尝试之外，也尝试了在棒状菌中同时扩增两个或更多个基因，进而改进L-赖氨酸生产。就此而言，DE-A-38 23 451报道了同时扩增大肠杆菌asd基因和dapA基因后，生产能力增加。DE-A39 43 117公开了用pJC50同时扩增编码反馈抗性天冬氨酸激酶的lysC等位基因和dapA基因后，生产能力增加。EP-A-0 841 395特别报道了同时扩增编码反馈抗性天冬氨酸激酶的lysC等位基因和dapB基因后，生产能力增加；进一步的改进可以由dapB，lysA，以及ddh基因的额外扩增完成。EP-A-0 854 189描述了同时扩增编码反馈抗性天冬氨酸激酶的lysC等位基因和dapA，dapB，lysA和aspC基因后生产能力增强。EP-A-0 857 784特别报道了同时扩增编码反馈抗性天冬氨酸激酶的lysC等位基因和lysA基因后生产能力增强；进一步的改进可以由ppc基因的额外扩增完成。

由许多现有技术的文献中所描述的方法可以清楚看出，需要开发新的方法并改进用棒状菌生产赖氨酸的现行的方法。

本发明的目的是通过新的措施提供改进的棒状菌的L-赖氨酸生产菌株。

L-赖氨酸是商业上重要的L-氨基酸，尤其是用作动物营养中的饲料添加剂。

当L-赖氨酸或赖氨酸在下文中提及时，应当理解为其不仅包括其本身，而且包括适当的盐，例如赖氨酸盐酸盐或赖氨酸硫酸盐。

本发明提供了棒状菌的L-赖氨酸生产菌株，它们具有扩增的lysE基因(赖氨酸输送载体基因)，其中它们还含有单独或一起扩增的、优选超量表达的选自包括dapA基因(二氢吡啶二羧酸合酶基因)，lysC基因(天冬氨酸激酶基因)，dapB基因(二氢吡啶二羧酸还原酶基因)和pyc基因(丙酮酸羧化酶基因)组的基因，尤其是dapA基因和lysC基因。