[发明专利]一种手性－反－第一菊酸的酶拆分制造方法

说明书

本发明涉及手性R(+)-反-第一菊酸，特别提供了一种用酶拆分方法制造手性R(+)-反-第一菊酸的技术。

第一菊酸(又称菊酸，英文名称Chrysanthemic acid)是合成拟除虫菊酯农药的酸部分组成的重要中间化合物。第一菊酸，即2，2-二甲基3-(2-甲基-1-丙烯基)环丙烷羧酸，如(I)所示

因它的环丙烷环上存在两个手性碳原子，因此有R(+)和S(-)两种构型，还有顺式和反式两种异构，共有四种异构体。作为拟除虫菊酯农药的酸部组成，不同异构体的第一菊酸，其杀虫效力表现出显著的差异。其中手性R(+)第一菊酸是有效体，而手性S(-)第一菊酸是无效体；对顺式和反式结构，一般而言，R(+)-反-菊酸效力最高，而R(+)-顺-菊酸则次之。当今，合成高效、低毒有益于环境保护的手性农药已成为重要的发展趋势。因此在工业上制造R(+)第一菊酸，是生产手性拟除虫菊酯农药的重要中间体，具有较高价值。

目前，虽然化学拆分法可以制造手性R(+)第一菊酸，但是需要使用价格很高的光学活性试剂，而且工艺流程比较繁杂。由手性催化剂催化环丙烷化虽然可以得到R(+)-反-第一菊酸，但尚难达到很高的光学活性。因此研究开发方便经济的生物催化剂拆分法制造R(+)-反-第一菊酸成为一个新的重要途径。

以生物催化剂动力学拆分法制造R(+)-反-第一菊酸，已报道的文献有：1.猪肝酯酶拆分法(M.Schneider et al.，Angew.Chem.Int.Ed.Eg.，23：64(1984))。2.球形节杆菌(Arthobacter globiformis)及其酯酶拆分方法(SMitsuda et al.，Agric.Biol.Chem.，55，2865(1991))。

猪肝酯酶拆分法，使用活力高的酶，得到了R(+)-第一菊酸的光学活性(纯度)达70％，但是，猪肝酯酶价格偏高，供生产使用有一定的限制，需通过酶固定化来解决。

球形节秆菌酯酶拆分法，水解率4.0％时，第一菊酸的R(+)-反/R(+)-顺＝100，但是，此菌种难以得到，而且未经诱变或基因工程改造的菌株，活力比较低。

本发明的目的在于提供一种手性R(+)-反-第一菊酸的酶拆分制造方法，该方法对目的物手性第一菊酸的选择性高，而且在生产上可以方便地实施。

本发明提供了一种手性R(+)-反-第一菊酸的酶拆分制造方法，以消旋的(±)-第一菊酸酯为原料，以酯酶为催化剂，催化(±)-第一菊酸酯不对称水解反应；其特征在于：

(1)(±)-第一菊酸酯中顺式与反式异构体比例在10～90/90～10范围之间，在反应溶液中(±)-第一菊酸酯浓度在0.1～40％范围中；

(2)酯酶由新鲜猪肝或其他哺乳动物如马.狗.兔等肝脏或某些细菌或酵母菌提取，活力不低于0.1u/mg，酯酶的用量为底物第一菊酸酯的0.1～10％；

(3)加入特定的添加物改变酶反应的微环境，特定添加物选自寡糖、多糖、非离子型表面活性剂之一种或多种，每种添加物在反应体系中的浓度在0.001～0.2％范围内。

(4)反应介质为无机盐缓冲溶液、有机盐缓冲溶液、蒸馏水、脱离子水之一种；

(5)水解反应在搅拌或振荡下进行，水解反应温度在20～70℃范围内，水解反应时间6～96小时，控制反应溶液pH在3～11范围内。

本发明所用的原料为消旋的第一菊酸酯，如(II)所示

R为C₁-C₄烷基及孟基，其顺式与反式比例在10～90/90～10范围内。

本发明所用的酯酶(EC.3.1.1.1)是由新鲜的哺乳动物(如猪、马、狗、兔等)的肝脏提取的酯酶粗提物，如日本天野酶公司的产品，美国Sigma化学公司的产品和本实验室的提取物，或由细菌和酵母菌提取的酯酶粗提物。酯酶活力在0.1-20u(国际单位)/mg范围内。酯酶可以固态或液态形态使用，可以吸附或共价键合方法固定于无机或有机载体上使用，固定化酶便于酶回收反复使用。

本发明所用的特定添加物为寡糖及多糖类化合物(如乳糖、蔗糖、麦芽糖、棉子糖、葡聚糖、琼脂糖、糊精等)和非离子型表面活性剂(如蓖麻油聚氧乙烯、脂肪醇聚氧乙烯醚、壬基酚聚氧乙烯醚、失水梨糖脂肪酸酯、聚氧乙烯失水山梨糖醇脂肪酸酯、蔗糖脂肪酸酯等)。