[发明专利]一种多重归一化基因扩增方法

说明书

本发明涉及一种基因扩增方法，尤其涉及一种多重基因的归一化基因扩增方法。

基因扩增技术或称聚合酶链式反应(Polymol/Lerase Chain Reaction.PCR)是八十年代发展起来的一项分子生物技术，其原理类似体内天然DNA复制，主要是利用DNA聚合酶依赖DNA模板的特性，模仿体内DNA复制过程，在附加的一对引物之间诱发聚合反应。PCR全过程是基于一套“三步曲”的若干次的循环组合而成，其中每一步的转换则是通过温度的改变来控制，三步过程分别为1、DNA热变性：加热使靶DNA双链解离；2、引物退火，体系温度降低，使两个引物分别结合到靶DNA的两条链的3′末端；3、引物延伸，在DNA聚合酶的催化下，引物沿着靶DNA链的3′末端向5′末端延伸，至此完成一个循环，整个PCR过程一般需要30～50循环，可将DNA扩增百万倍以上(《PCR技术指南》C.W迪芬巴赫和G.S德维克斯勒者、黄培堂等译，科学出版社1999年)，这种基轩扩增技术广泛应用于生命科学、医学研究、遗传工程、疾病诊断、法医学、农业、考古学等领域的基因分析，基因克隆等，但这种扩增方法对多基因分析有缺陷，即仅对单一基因，且最多仅能同时扩增10个左右的基因，不能同时扩增更多的基因，这给大量基因的分析工作带来了局限性。

本发明的目的是提供一套多重基因扩增方法，此法利用巧妙的PCR引物设计，可有效解决多基因的同时扩增。

本发明的目的是通过如下技术方案实现的：首先在扩增引物的5′端增加长度为17～25核苷酸的共有引物片段，进行初始扩增，然后用共有引物引发扩增，形成归一化扩增。

如附图所示。

初始化扩增是指由特异性引物引发的特异基因片段的扩增。

归一化扩增是指由共有引物引发的扩增。

优选方法可采用1、三次扩增：①逆转录和初始化扩增；②第二次扩增；③第三次扩增；2、二次循环法；3、一次扩增。

第二次扩增是取初始扩增产物1～2μmol/L，加入反应体系，另加特异引物进行的扩增；第三次扩增是取第二次扩增产物1～2μmol/L，加入反应体系及共有引物进行的扩增；二次循环法中第一循环引物为各0.001～0.01μmol/L，N和RT引物，扩增25循环，第二循环引物为0.1～0.3μmol/L，T引物，扩增25～40循环；一次扩增是取引物N和RT 0.001～0.01μmol/L，T为0.1～0.3μmol/L，扩增35～45循环。

第二次扩增中，另加的特异引物是R和N引物，含0.005～0.05μmol/L的T引物的RT引物。

本发明基于巧妙的PCR引物设计，可大量分析多重基因的归一化PCR方法，这种方法理论上可同时扩增无数个基因，实际工作中可同时扩增30个以上的基因，大大提高了基因分析的工作效率。

附图为本发明技术方案示意图。其中，R：针对目的基因的常规特异性引物RT：带有共有序列的常规特异性引物N：位于R和RT之间带有共有序列的常规特异性引物

T：共有引物

下面结合扩增精液cDNA为例对本发明做进一步说明。

1.样品制备

1.1裂解液：220mmol/L KOH加入500mmol/L DTT，混合比例9∶1

1.2中和缓冲液：200mmol/L HCl 900mmol/L Tris-HCl(PH＝8.3)

1.3步骤：

①20μl(精液)加入100μl裂解液60℃10分钟。

②加100μl中和缓冲液。

③乙醇沉淀，沉淀样做PCR。

注：①不同的样品可用不同的裂解液，或用其他样品制备方法。

    ②若用裂解液直接用做PCR，注意K⁺离子浓度影响扩增。

2.扩增

2.1溶液：①10×PCR缓冲液

           100mmol/L Tris-HCl(PH8.3)

           500mmol/L KCl

           20mmol/L MgCl₂

           100μg/ml

         ②900mmol/L Tris-HCl(PH8.3)

2.2三步扩增法

2.2.1逆转录和初始扩增

①样品中加入反应体系

  1×PCR缓冲液

  90mmol/L Tris-HCl(PH8.3)

  100mmol/L dNTP